mRNA转染的抗原呈递细胞制造技术

一种扩增ＲＮＡ的方法，其获得主要是有义方向的ＲＮＡ分子，基本不含反义方向的ＲＮＡ分子。也提供了用含有编码免疫原性抗原的有义ＲＮＡ且基本不含反义ＲＮＡ和ｄｓＲＮＡ的组合物转染抗原呈递细胞的方法，以及按照该方法制备的树突细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本文公开的主题涉及一种扩增RNA的方法，以根据所需的功能获得主要为有义方向或反义方向的RNA分子。也提供了一种用编码肿瘤抗原或微生物抗原的有义RNA转染抗原呈递细胞的方法，以及根据本文公开的方法制备的抗原呈递细胞。
技术介绍
T淋巴细胞在对传染原和肿瘤细胞的免疫应答中，以及在器官移植排斥和自身免疫中起重要作用。只有在抗原以与抗原呈递细胞表面上的MHC分子相结合的小片段形式呈递给T细胞时，T细胞才识别该抗原。为了使T细胞产生应答，抗原呈递细胞(APC)必须向静息T淋巴细胞提供两种信号。第一种信号使免疫应答具有特异性，是在识别主要组织相容性复合物(MHC)中呈递的外源抗原肽后通过T细胞受体(TCR)转导的。第二种信号诱导T细胞增殖及成为功能性的。因此抗原呈递是诱导免疫应答中的一个重要步骤。曾经使用各种方法将抗原递送给APC，以试图诱导对该特定抗原的免疫应答。这些方法包括使用病毒载体、将抗原插入脂质体中以及用纯化的抗原或重组蛋白直接脉冲细胞。最近报道了一种基于用RNA转染APC的抗原递送系统。美国专利6,306,388号和5,853,719号和相关专利和申请公开了用负载RNA的抗原呈递细胞治疗或预防癌症和病原体感染的方法，在此引入作为参考。简而言之，即扩增肿瘤总RNA或选择的编码肿瘤抗原的RNA，并将其转染到树突细胞内。用病原体来源的RNA转染的抗原呈递细胞也可以用于传染性疾病的治疗。基于抗原修饰的树突细胞的疫苗在有效的抗肿瘤免疫方面具有广阔的前景，RNA被公认为是向树突细胞(DC)递送抗原的一种载体(Mitchell和Nair，2000；Nair和Boczkowski，2002；Ponsaerts等，2003；和Ponsaerts等，2002)。编码抗原的肿瘤RNA克服了其他抗原递送方法所固有的限制，因为它提供了最广泛可能的肿瘤抗原库(repertoire)，既不需要特异性HLA单倍型也不需要鉴定和表征总RNA群体中存在的确定的肿瘤抗原。现在已经肯定地证明，RNA-转染的DC能够刺激主要溶细胞性T细胞(CTL)应答(Boczkowski等，1996)。有大量研究已经证实该方法在各种模型中的可行性。一项使用肾细胞癌总RNA转染的DC的研究证明了对原发性和转移性肿瘤的T细胞反应性的有效刺激(Heiser等，2001a)。另外一些体外研究证明，负载自体肿瘤RNA的DC能够诱导对膀胱癌(Schmitt等，2001)、多发性骨髓瘤(Milazzo等，2003)、乳腺癌(Müller等，2003)和结肠直肠癌(Nencioni等，2003)的特异性CTL。已经对结肠直肠癌(Rains等，2001)、肾细胞癌(Su等，2003)和恶性胶质瘤(Kobayashi等，2003)进行了利用负载自体肿瘤总RNA的DC检验接种策略的临床试验。总RNA中只有一小部分，即2-3％，对应于mRNA或抗原编码类型。富集RNA中的mRNA提高了编码RNA类型在递送给DC的相同质量RNA中的比例。一种富集编码RNA类型的方法是利用物理分离方法分离polyA+RNA。已经描述了制备临床级基于DC的用前列腺细胞系mRNA转染的疫苗的方法(Mu等，2004)，并且启动了使用所开发方法的临床试验(Mu等，2003)。富集编码RNA群体的另一种方法是偏向于只扩增聚腺苷酸化类型的RNA扩增。进行的研究证明了能够从小肿瘤样本中大量扩增RNA，从而富集编码类型，而不丧失其生物学功能(Boczkowski等，2000)。在一项旨在确定从肿瘤总RNA扩增的RNA是否仍然保留其生物活性的研究中，用从黑色素瘤细胞系扩增的RNA转染的鼠DC产生抗肿瘤CTL应答。该研究中描述的RNA扩增方案也用于来自显微切割的激光切片的前列腺肿瘤细胞，其中报道使用自体患者材料诱导肿瘤特异性的CTL(Heiser等，2001b)。因此，使用肿瘤RNA作为抗原来源具有另一个优点，即只需要少量从中可以提取和扩增的输入肿瘤组织。mRNA(polyA+RNA)转变为互补DNA，以及随后的序列扩增，是分子生物学领域技术人员公知的基本技术。这些基本技术的各种变化方案的描述可见美国专利5,962,271、5,962,272和6,593,086号，其内容在此引入作为参考。例如，发表的RNA扩增方案使用模板转换技术(Chenchik等，1998)。该技术的示意图在附图说明图1A中示出。该技术利用MMLV逆转录酶的RNAseH-缺陷型突变体的独特性质，来掺入其他残基，主要是在合成的第一链cDNA的5’末端处添加胞嘧啶。如果在第一链合成反应中存在3’末端处含有几个连续G残基的寡核苷酸，则在G和C核苷酸之间将发生Watson-Crick碱基配对。一旦逆转录酶到达转录物的5’末端，即转换模板，并从退火的寡核苷酸的限定序列继续转录。cDNA的3’末端通过含有其他确定序列的poly-dT寡核苷酸的退火限定。第一链cDNA的限定的3’和5’末端允许不受限制的基于PCR的扩增。为了使扩增产物中的抗原序列随后能够转录和翻译，通过向PCR反应中使用的含G寡核苷酸(capswitch)中添加T7启动子序列，引入T7RNA聚合酶启动子序列。该模板转换方案最早由Chenchik等人报道，其设计是为了易于操作，并且易于随后亚克隆到质粒载体中。在该方案中，capswitch和poly-dT寡核苷酸都含有丰余序列。这允许在PCR反应中使用单一寡核苷酸进行扩增。例如，如果第一链cDNA合成使用含T7的寡核苷酸，并且PCR步骤使用含T7的寡核苷酸，则该寡核苷酸能够与该cDNA的5’末端和3’末端都退火。PCR终产物将在两个末端都具有T7RNA聚合酶结合位点。因此，在随后的转录反应中，RNA聚合酶将结合到5’和3’末端，合成有义和反义方向的RNA。用有义和反义方向的RNA转染抗原呈递细胞都产生有希望的结果。但是，这些方法对抗原呈递细胞的负面影响以前没有认识到。因此，需要优化编码抗原的mRNA在树突细胞和其他抗原呈递细胞中表达的方法。本专利技术满足了这一需要。专利技术概述在本文公开主题的一个实施方案中，提供了用至少一种mRNA转染抗原呈递细胞的方法。该方法包括通过如下步骤制备基本不含反义方向的RNA和双链RNA、而包含至少一种有义方向的mRNA的制品(i)从样品中扩增至少一种mRNA，产生多核苷酸模板，其中该多核苷酸模板含有适于体外转录的启动子，该启动子只是可操作地连接到该多核苷酸模板的有义链；和(ii)体外转录该多核苷酸模板，产生至少一种有义方向的mRNA，其中该多核苷酸模板不是克隆的模板；和用来自该制品的至少一种有义方向的mRNA转染至少一种抗原呈递细胞。在该方法的一些实施方案中，从样品中扩增mRNA包括从样品中逆转录该mRNA，产生含有cDNA的多核苷酸模板；利用第一引物和第二引物扩增该多核苷酸模板cDNA，其中第一引物和第二引物中只有一个将适于体外转录的启动子插入该多核苷酸模板cDNA中。在一些实施方案中，第一引物含有poly T延伸和与第二引物基本没有序列同源性的5’序列，第二引物含有适于体外转录的启动子。在本文公开主题的另一实施方案中，提供了通过上述方法制备的负载mRNA的抗原呈递细胞。在一些实施方案中，该抗原呈递细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用至少一种ｍＲＮＡ转染抗原呈递细胞的方法，其包括：（ａ）通过如下步骤制备基本不含反义方向ＲＮＡ和双链ＲＮＡ并且含有至少一种有义方向ｍＲＮＡ的制品：（ｉ）从样品中扩增至少一种ｍＲＮＡ，产生多核苷酸模板，其中该多核苷酸模板含 有适于体外转录的启动子，该启动子只与该多核苷酸模板的有义链可操作地连接；和（ｉｉ）体外转录所述多核苷酸模板，产生至少一种有义方向的ｍＲＮＡ，其中所述多核苷酸模板不是克隆的模板；和（ｂ）用来自该制品的所述至少一种有义方向的ｍＲ ＮＡ转染至少一种抗原呈递细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾里纳切雷帕诺瓦，
申请(专利权)人：阿哥斯医疗公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]