一种小鼠甲状腺上皮细胞分离及培养方法技术

本发明专利技术提供一种小鼠甲状腺上皮细胞分离及培养方法，包括步骤：(a)腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，酒精消毒后取出与气管相连的小鼠甲状腺组织，置于预冷无菌含双抗的PBS缓冲液中浸泡洗涤，并剥离甲状腺组织；(b)机械解离甲状腺组织后，预热混合酶液震荡消化30-40min，Ficoll分离甲状腺单个核细胞，离心获取细胞沉淀；(c)混合完全培养基重悬细胞沉淀，接种于处理后的细胞瓶中，差速贴壁法获得甲状腺上皮细胞；(d)混合完全培养基培养纯化后的甲状腺上皮细胞。本发明专利技术提供的小鼠甲状腺上皮细胞分离及培养方法可获得产量高、纯度高且生存时间较长的小鼠甲状腺上皮细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种小鼠甲状腺上皮细胞分离及培养方法。
技术介绍
甲状腺是脊椎动物非常重要的腺体，属于内分泌器官，位于哺乳动物颈部甲状软骨下方，气管两旁。其中，甲状腺上皮细胞(也称为滤泡细胞或主要细胞)在甲状腺细胞中是负责生产和分泌甲状腺激素，包括四碘甲状腺原氨酸(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)，具有调节动物体生长发育、基础代谢及繁殖活动的重要生理功能。甲状腺功能异常会引起甲状腺腺瘤、甲状腺癌、原发性甲状腺功能亢进和减退等疾病，甲状腺细胞的体外培养是甲状腺疾病研究的一种重要方法。目前有关甲状腺原代培养的组织多取材于体型较大的哺乳动物，如猪、狗、绵羊、兔等，成本较高，而且培养的甲状腺细胞的体外生存时间和功能差异也较大。由于小鼠的甲状腺组织较小，取材和后续处理有一定难度，但是小鼠繁殖率高，可以降低实验成本，而且生物学性质清晰而且便于操作等优势，是研究人类疾病最佳的模式生物之一，本专利技术所提供得甲状腺上皮细胞的分离培养方法可以获得产量高、纯度高且生存时间较长的小鼠甲状腺上皮细胞。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种获得产量高、纯度高且生存时间较长的小鼠甲状腺上皮细胞分离培养的方法。为了解决上述所涉及到的问题，本专利技术采取如下方法获得小鼠甲状腺上皮细胞：小鼠甲状腺上皮细胞分离方法的步骤包括：(a)腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，酒精消毒后取出与气管相连的小鼠甲状腺组织，置于预冷无菌含双抗的PBS缓冲液中浸泡洗涤，并剥离甲状腺组织；(b)机械解离甲状腺组织后，预热混合酶液震荡消化30-40min，Ficoll分离甲状腺单个核细胞，离心获取细胞沉淀；(c)混合完全培养基重悬细胞沉淀，接种于处理后的细胞瓶中，差速贴壁法获得甲状腺上皮细胞；(d)混合完全培养基培养纯化后的甲状腺上皮细胞。可选的小鼠为体重20-25g，6-8周龄的小鼠。可选的消化所用消化酶液为预先在37℃预热的0.05％-0.1％(m/v)胰酶、0.1％-0.2％(m/v)I型胶原酶、0.05％-0.15％(m/v)II型胶原酶和1-2U/mL中性蛋白酶的酶混合液，消化时间为30-40min；可选的震荡消化的方法为37℃水浴震荡，震荡频率为250-300次/min；可选的细胞瓶的处理方法为含5％的小鼠血清37℃孵育过夜；可选的差速贴壁方法为细胞悬液在37℃培养箱中贴壁20-30min后，将未贴壁的细胞悬液重新转接于新的包被板中，重复一次该步骤。可选的混合完全培养基的基础培养基为RPMI1640、DMEM/F12和α-MEM(1∶1∶1～1∶1.5∶1)。可选的混合完全培养基中的添加因子为100μg/mL牛垂体和下丘脑提取物、10ng/mL氢化可的松、10μg/mL胰岛素、20-50ng/mL三碘甲状腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生长因子EGF和5％-10％的小鼠血清。本专利技术提供的小鼠甲状腺上皮细胞分离方法中消化液选用预热的0.05％-0.1％(m/v)胰酶、0.1％-0.2％(m/v)I型胶原酶、0.05％-0.15％(m/v)II型胶原酶和1-2U/mL中性蛋白酶混合液用以消化细胞，一方面减少了胰酶的用量，降低了胰酶对甲状腺上皮细胞的损伤，提高了细胞的存活率，另一方面节省了消化所需时间。本专利技术提供一种混合完全培养基培养甲状腺细胞的方法，增加了甲状腺上皮细胞的生存期，以及减少了添加因子的种类，降低了成本。进一步的，本专利技术选用加入含有100μg/mL牛垂体和下丘脑提取物、10ng/mL氢化可的松、10μg/mL胰岛素、20-50ng/mL三碘甲状腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生长因子EGF和10％的小鼠血清的混合完全培养基作为生长初期的细胞接种液，待细胞长成单层时，更换为含5％小鼠血清的混合完全培养基，促进小鼠甲状腺细胞保持较长时间的上皮样。本专利技术解决了甲状腺上皮细胞分离培养过程成本高，存活时间短的问题，使获得的小鼠甲状腺上皮细胞产量高、纯度高且生存时间较长。附图说明图1：培养5天的小鼠甲状腺上皮细胞；图2：小鼠甲状腺上皮细胞免疫荧光鉴定。具体实施方式为了使本专利技术的目的及优势更清新地展现，现将具体实施方式进一步阐述。此处所阐述的具体实施方式仅针对本专利技术进行解释，并不用于限定本专利技术。本专利技术选择6-8周龄的雄性小鼠，分离甲状腺上皮细胞。具体操作如下：1、取6-8周龄的雄性小鼠，腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，固定小鼠，75％的酒精消毒后取出与气管相连的小鼠甲状腺组织，置于预冷无菌含双抗的PBS缓冲液中浸泡洗涤，并剥离甲状腺组织；2、在冰上于显微镜下迅速地去除甲状腺上的包膜、血细胞及结缔组织等附着物，将剥离后的甲状腺转至新的PBS缓冲液中清洗2次；3、在冰上用解剖剪机械剪碎甲状腺组织，大小约1mm3左右的碎块；4、将剪碎的组织加入预热的4-5倍体积的消化混合液，于37℃震荡消化30-40min，震荡频率为250-300次/min；所述消化混合液包括0.05％-0.1％(m/v)胰酶、0.1％-0.2％(m/v)I型胶原酶、0.05％-0.15％(m/v)II型胶原酶和1-2U/mL中性蛋白酶；5、吹打使细胞分散，经200目筛网过滤后，加入至含Ficoll的分离液中，2000r/min离心，取中间白色层，1500rpm/min离心5min，弃上清；6、制备含10％小鼠血清的混合完全培养基：将RPMI1640、DMEM/F12和α-MEM培养基按照1∶1∶1～1∶1.5∶1比例配置成混合基础培养基，在混合基础培养基中加入100μg/mL牛垂体和下丘脑提取物、10ng/mL氢化可的松、10μg/mL胰岛素、20-50ng/mL三碘甲状腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生长因子EGF和10％的小鼠血清。制备含5％小鼠血清的混合完全培养基：将RPMI1640、DMEM/F12和α-MEM培养基按照1∶1∶1～1∶1.5∶1比例配置成混合基础培养基，在混合基础培养基中加入100μg/mL牛垂体和下丘脑提取物、10ng/mL氢化可的松、10μg/mL胰岛素、20-50ng/mL三碘甲状腺原氨酸、20-50ng/mL表皮生长因子EGF和5％的小鼠血清。7、用10％小鼠血清的混合完全培养基重悬细胞沉淀，接种于经5％的小鼠血清37℃孵育过夜处理后的细胞瓶中，置于37℃、5％(m/v)的CO2饱和湿度的培养箱中培养20-30min后，将未贴壁的细胞悬液转移至新的处理后的细胞瓶中，重复一次上述差速贴壁步骤。8、培养24h后，更换为5％小鼠血清的混合完全培养基，显微镜下可见细胞贴壁，呈聚集生长，细胞呈圆形或椭圆形。9、免疫荧光鉴定：(1)待细胞生长5d后，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4％多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；(2)PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％TritonX-100透膜15min；(3)PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4％BSA封闭细胞30min；(4)按1∶100的比例稀释单克隆Cytokeratin-18一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育过夜；(5)PBS冲洗细胞3次，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小鼠甲状腺上皮细胞分离及培养方法，其特征在于，包括步骤：(a)腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，酒精消毒后取出与气管相连的小鼠甲状腺组织，置于预冷无菌含双抗的PBS缓冲液中浸泡洗涤，并剥离甲状腺组织；(b)机械解离甲状腺组织后，预热混合酶液震荡消化30‑40min，Ficoll分离甲状腺单个核细胞，离心获取细胞沉淀；(c)混合完全培养基重悬细胞沉淀，接种于处理后的细胞瓶中，差速贴壁法获得甲状腺上皮细胞；(d)混合完全培养基培养纯化后的甲状腺上皮细胞。

【技术特征摘要】
1.一种小鼠甲状腺上皮细胞分离及培养方法，其特征在于，包括步骤：(a)腹腔注射戊巴比妥钠处死小鼠，酒精消毒后取出与气管相连的小鼠甲状腺组织，置于预冷无菌含双抗的PBS缓冲液中浸泡洗涤，并剥离甲状腺组织；(b)机械解离甲状腺组织后，预热混合酶液震荡消化30-40min，Ficoll分离甲状腺单个核细胞，离心获取细胞沉淀；(c)混合完全培养基重悬细胞沉淀，接种于处理后的细胞瓶中，差速贴壁法获得甲状腺上皮细胞；(d)混合完全培养基培养纯化后的甲状腺上皮细胞。2.根据权利要求1所述的小鼠甲状腺上皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述的小鼠为20-25g，6-8周龄的小鼠。3.根据权利要求1所述的小鼠甲状腺上皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤b消化所用的消化酶液为预先在37℃预热的混合液，消化时间为30-40min；所述混合液包括0.05％-0.1％(m/v)胰酶、0.1％-0.2％(m/v)I型胶原酶、0.05％-0.15％(m/v)II型胶原酶和1-2U/mL中性蛋白酶。4.根据权利要求1所述的小鼠甲状腺上皮细胞分离及培养方法，其特征在于，所述步骤b震荡消化的方法为37℃水浴震荡，震荡频率为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：张清，蒋敏，张亚洲，齐来俊，
申请(专利权)人：江苏齐氏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32