穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白及其制备方法和应用技术

一种穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白，全长为59个氨基酸，其氮端为穿膜肽序列，碳端为β防御素3成熟肽序列，两肽段之间用2个甘氨酸和1个丝氨酸相连，分子量为6.7KD。制备方法由基因的获得、毕赤酵母表达载体的构建、穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白毕赤酵母基因工程菌的构建、穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白毕赤酵母发酵、穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白的纯化步骤组成。穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白在制备杀菌凝胶的用途和制备面膜化妆品的用途以及制备爽肤水化妆品的用途。

Transmembrane peptide human beta defensin 3 fusion protein and preparation method and application thereof

A membrane penetrating peptide human beta defensin 3 fusion protein contains 59 amino acid, its N-terminal for transmembrane peptide sequence, C-terminal for beta defensin 3 mature peptide sequence between the two peptides with 2 glycine and serine 1 connected, molecular weight is 6.7KD. The preparation method comprises obtaining, Pichia pastoris expression construct, peptide human beta defensin 3 fusion protein in Pichia pastoris vector construction, membrane penetrating peptide of human beta defensin 3 fusion protein in Pichia pastoris, peptide human beta defensin 3 fusion protein purification step gene. Transmembrane peptide human beta defensin 3 fusion protein in the gel preparation of bactericidal preparation and use of cosmetics mask and preparation toner for cosmetic purposes.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及到穿膜肽-人β防御素3融合蛋白。
技术介绍
抗菌肽(antibacterialpeptides)，又称为肽抗生素或称为抗微生物肽，是生物防御系统产生的一类防御外源性病原体的肽类物质。抗菌肽广泛分布于植物、动物、昆虫及人体内，具有较强的抵抗微生物入侵的活性，是机体免疫系统的重要组成部分。人防御素(Defensin)属于抗菌肽家族，是近年来发现的一类新型富含精氨酸的阳离子抗菌多肽，根据其来源及分子内二硫键的连接方式不同，将其分为两大类：α防御素、β防御素，其中β防御素主要存在于人的粘膜、呼吸道等上皮组织细胞，由Harder等人于2001年从牛皮癣患者的皮肤脱落物中分离得到，迄今为止，已经发现和鉴定的人β防御素主要有4种，即β防御素1、β防御素2、β防御素3、β防御素4，与防御素家族其他成员相比，β防御素3具有更广的抗菌谱，对革兰氏阴性菌和阳性菌均有抗菌活性，而且抑菌所需浓度远低于其他人β防御素。对多重耐药菌株，β防御素3也显示出强有力的抗性，更重要的是其抗菌活性受盐浓度影响相对较小，对宿主细胞的毒性很低。此特点使其有望成为一种新型肽类抗菌素。人β防御素3的相对分子量为5154.7，由1个α螺旋和3个反向平行的β折叠片层组成，另外在氨基末端区域内形成一个短螺旋环。β防御素3的6个半胱氨酸残基形成3个二硫键，二硫键的连接方式为Cysl-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6。二硫键的存在，在一定程度上保持了β防御素3分子的稳定性，增强了其抵抗蛋白酶水解的能力。β防御素3具有两性分子结构，正电荷分布在肽表面两侧，而疏水残基簇生在肽表面的底部。β防御素3分子的疏水性与其抗菌活性密切相关，疏水作用被认为是β防御素3透化细菌细胞膜机制中不可缺少的。β防御素3在人类先天免疫反应中发挥着重要的作用，大量的研究证实，β防御素3具有显著的抗细菌活性。β防御素3杀灭细菌的关键环节是能在细菌胞膜上形成孔道，从而直接杀灭细菌。体外试验的研究结果表明，β防御素3对革兰阳性菌的最小抑菌浓度为0.4-6.25mg/L，对革兰阴性菌的最小抑菌浓度为1.56-16mg/L，比防御素家族的其他成员，如：β防御素1、β防御素2对细菌的抑菌浓度更低，这是因为β防御素3的结构中含有13个精氨酸和赖氨酸，能够在浓度很低的时候，通过13片层形成对称的二聚体，而β防御素1和β防御素2均为单体结构，所以，β防御素3抑菌活性较β防御素1和β防御素2更强，最小抑菌浓度更低，β防御素3对真菌同样具有抑制作用，但目前对其抑制真菌的作用机制尚不明确。除了细菌、真菌，β防御素3还具有抗包膜病毒的作用，特别是对艾滋病毒的抑制作用受到了广泛的关注。另有研究表明，β防御素3还可充当黑皮素1受体(melanocortin1receptor,MC1R)的配体，与α-促黑素(α-melanocyte-stimulatinghormone,α-MSH)竞争性和MC1R结合，呈剂量依赖性降低环磷酸腺苷cAMP水平，抑制酪氨酸酶(tyrosinae,TYR)活性，降低表皮细胞黑素的沉积。皮肤是人体最大的器官，其结构组成包括最外面的表皮层、中间的真皮层、最底部位于真皮下的皮下组织。在机体防御过程中，它是身体的第一层保护系统，可以阻止外来物理性、化学性、机械性和病原危生物等各种有害物质的侵入，同是也是防止体内水分、电解质等物质扩散至体外的保护层，维持体内稳定的内环境，并且参与机体的新陈代谢，具有重要的生理保护功能。β防御素3以外源蛋白的形式作用于皮肤表面，因皮肤的屏障作用，很难穿过皮肤的表皮层发挥其抑菌及抑制黑色素沉积的作用，阻碍β防御素3的临床治疗研究及应用。近年来，在生物细胞学研究领域中陆续发现了一些具有细胞穿透功能的氨基酸序列，长度多数小于20个氨基酸，被命名为穿膜肽(Cell-penetratingpeptides,CPPs)或蛋白转导域(Proteintransductiondomains,PTDs)，它们可以携带多种物质，包括亲水性蛋白、多肽、DNA甚至颗粒性物质等进行细胞间/内的传输，并且不受细胞类型的限制；另外研究发现，穿膜肽携带大分子蛋白在皮肤局部给药时可穿透皮肤真皮层，在细胞生物学、基因治疗学以及药学等领域具有很大的研究价值。
技术实现思路
本专利技术所要解决的一个技术问题在于克服外源蛋白不易透过皮肤屏障的缺点，提供一种可透皮转运的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白。本专利技术所要解决的另一个技术问题在于提供一种快速、简便的穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的制备方法。本专利技术所要解决的还有一个技术问题在于为穿膜肽-人β防御素3融合蛋白提供一种新用途。解决上述技术问题采用的技术方案是：穿膜肽-人β防御素3融合蛋白，全长为59个氨基酸，其氮端为穿膜肽序列，碳端为人β防御素3序列，两肽段之间用二个甘氨酸和一个丝氨酸相连，分子量为6.7KD；该穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的氨基酸序列如下：1YARVRRRGPRRGGSGIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKK其中穿膜肽氨基酸序列为：1YARVRRRGPRR人β防御素3氨基酸序列为：1GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKK穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的核苷酸序列为：上述穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的制备方法如下：1、基因的获得根据毕赤酵母密码子偏好性，设计并全基因合成穿膜肽-人β防御素3融合蛋白核苷酸序列，并在两端添加限制性内切酶酶切位点XhoⅠ和EcoRⅠ以及pPIC9K载体自身α信号肽切割位点序列AAAAGA，命名为HPH-BD3，其核苷酸序列如下：2、毕赤酵母表达载体的构建对载体pPIC9K、HPH-BD3进行XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接pPIC9K与HPH-BD3，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-HPH-BD3，pPIC9K载体购于美国Invitrogen公司。3、穿膜肽-人β防御素3融合蛋白毕赤酵母基因工程菌的构建将10μg经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-HPH-ASIP质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布最小葡萄糖培养基平板，30℃倒置培养2～3天，将最小葡萄糖培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种于含有遗传霉素(购自于陕西昕泰科技有限责任公司)浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上，30℃培养，筛选高拷贝阳性克隆。4、穿膜肽-人β防御素3融合蛋白毕赤酵母发酵将筛选到的阳性克隆接种于400ml毕赤酵母诱导表达前培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L基础盐培养基的5L发酵罐中，30℃、pH值为5.0培养16～20小时，作为二级种子转接入装有基础盐培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度26℃～28℃，pH值为4.5～5.5，溶氧控制在30％～40％，基础盐培养基中的甘油耗尽时，流加质量百分浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白，其特征在于：它的全长为59个氨基酸，其氮端为穿膜肽序列，碳端为人β防御素3序列，两肽段之间用2个甘氨酸和1个丝氨酸相连，分子量为6.7KD，该穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白的氨基酸序列为：1 YARVRRRGPR RGGSGIINTL QKYYCRVRGG RCAVLSCLPK EEQIGKCSTR GRKCCRRKK其中穿膜肽氨基酸序列为：1 YARVRRRGPR R人β防御素3氨基酸序列为：1 GIINTLQKYY CRVRGGRCAV LSCLPKEEQI GKCSiTRGRKC CRRKK穿膜肽‑人β防御素3融合蛋白的核苷酸序列为：

【技术特征摘要】
1.一种穿膜肽-人β防御素3融合蛋白，其特征在于：它的全长为59个氨基酸，其氮端为穿膜肽序列，碳端为人β防御素3序列，两肽段之间用2个甘氨酸和1个丝氨酸相连，分子量为6.7KD，该穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的氨基酸序列为：1YARVRRRGPRRGGSGIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSTRGRKCCRRKK其中穿膜肽氨基酸序列为：1YARVRRRGPRR人β防御素3氨基酸序列为：1GIINTLQKYYCRVRGGRCAVLSCLPKEEQIGKCSiTRGRKCCRRKK穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的核苷酸序列为：2.一种权利要求1穿膜肽-人β防御素3融合蛋白的制备方法，其特征在于该方法由下述步骤组成：(1)基因获得根据毕赤酵母密码子偏好性，设计并全基因合成穿膜肽-人β防御素3融合蛋白核苷酸序列，并在两端添加限制性内切酶酶切位点XhoⅠ和EcoRⅠ以及pPIC9K载体自身α信号肽切割位点序列AAAAGA，命名为HPH-BD3，其核苷酸序列如下：(2)毕赤酵母表达载体的构建对载体pPIC9K、HPH-BD3进行XhoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，回收酶切产物，用DNA连接酶连接pPIC9K与HPH-BD3，并转化大肠杆菌，提取质粒，命名为pPIC9K-HPH-BD3；(3)穿膜肽-人β防御素3融合蛋白毕赤酵母基因工程菌的构建将10μg经SalⅠ内切酶线性化的pPIC9K-HPH-BD3质粒，与80μL毕赤酵母GS115感受态细胞混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中，电击4～10毫秒，加入1mL冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体混匀，涂布最小葡萄糖培养基平板，30℃倒置培养2～3天，将最小葡萄糖培养基平板上长出的菌落用无菌牙签对应接种到遗传霉素浓度分别为0.5g/L、1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L的酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上，30℃培养，筛选高拷贝阳性克隆；(4)穿膜肽-人β防御素3融合蛋白毕赤酵母发酵将筛选到的阳性克隆接种于400ml毕赤酵母诱导表达前培养基中，30℃振荡培养24小时，作为一级种子转接于装有4L基础盐培养基的5L发酵罐中，30℃、pH值为5.0培养16～20小时，作为二级种子转接入装有基础盐培养基的150L大罐发酵，生长温度30℃，诱导温度26℃～28℃，pH值为4.5～5.5，溶氧控制在30％～40％，基础盐培养基中的甘油耗尽时，流加质量百分浓度为50％的PTM1微量元素甘油溶液，基础盐培养基与PTM1微量元素甘油溶液的体积比为1:0.25，维持溶氧在30％～40％。发酵液的湿菌重达到200mg/mL时，停止补料，饥饿1小时，甘油耗...

【专利技术属性】
技术研发人员：李敏，侯增淼，李晓颖，赵金礼，杨小琳，
申请(专利权)人：陕西慧康生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61