重组菌株及其制备方法和生产L‑苏氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，特别涉及重组菌株及其制备方法和生产L‑苏氨酸的方法。该重组菌株以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和敲除iclR基因。本发明专利技术重组菌株经发酵培养，产苏氨酸的量可达15.3g/L，糖酸转化率可达18.5％，无质粒负担，构建方法简便。

Methods the recombinant strain and its preparation method and production of L thr

The present invention relates to the technical field of microorganisms, in particular relates to a method for recombinant strain and its preparation method and production of L thr. The recombinant strain was transformed with Escherichia coli as the starting strain, and the transformation includes: strengthening pntAB gene and knocking out iclR gene. The recombinant strain of the invention can be obtained by fermentation culture, the yield of threonine can reach 15.3g/L, the conversion rate of sugar acid can reach 18.5%, and the burden of plasmid is not easy.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物
，特别涉及重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法。
技术介绍
L-苏氨酸(Thr)是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一，其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。苏氨酸是一种重要的营养强化剂，可以强化谷物、糕点、乳制品，和色氨酸一样有缓解人体疲劳，促进生长发育的效果。医药上，由于苏氨酸的结构中含有羟基，对人体皮肤具有持水作用，与寡糖链结合，对保护细胞膜起重要作用，在体内能促进磷脂合成和脂肪酸氧化。其制剂具有促进人体发育抗脂肪肝药用效能，是复合氨基酸输液中的一个成分。同时，苏氨酸又是制造一类高效低过敏的抗生素-单酰胺菌素的原料。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵生产，多种细菌可用于L-苏氨酸生产，如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83；韩国专利申请公开号8022/87)。然而，传统诱变育种由于随机突变造成菌株生长缓慢及产生较多副产物，不易获得高产菌株。随着全球苏氨酸需求量的不断增加，高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中，利用大肠杆菌，通过缺失苏氨酸操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列，增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达，苏氨酸生产力提高22％。2016年梅花集团申请的中国专利201610119758.6中，通过强化thrA*BC、敲除tdh获得MHZ-0213-3菌株，该菌株苏氨酸产量为4.2g/L、转化率约为8.9％，且无质粒负担。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法。本专利技术提供的重组菌株经发酵培养，产苏氨酸的量可达15.3g/L，糖酸转化率可达18.5％。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种重组菌株，以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和敲除iclR基因。作为优选，强化pntAB基因为：将pntAB基因的天然启动子更换为Ptac启动子。在本专利技术提供的实施例中，出发菌株为大肠杆菌MHZ-0213-3。在本专利技术提供的一实施例中，重组菌株的保藏编号为CGMCCNo.13402。本专利技术还提供了一种重组菌株的构建方法，包括：以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和敲除iclR基因。作为优选，强化pntAB基因为：将pntAB基因的天然启动子更换为Ptac启动子。在本专利技术提供的实施例中，出发菌株为大肠杆菌MHZ-0213-3。作为优选，改造采用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行。本专利技术还提供了一种生产L-苏氨酸的方法，采用本专利技术的重组菌株或本专利技术构建方法构建得到的重组菌株为发酵菌株。作为优选，生产L-苏氨酸的方法为：将重组菌株进行活化，接种到种子培养基进行种子培养，然后接种到发酵培养基进行发酵培养。作为优选，种子培养基包括：作为优选，发酵培养基包括：作为优选，活化的温度为37℃，时间为18～24h。作为优选，种子培养的温度为37℃，转速为90rpm，时间为4.5～5.5h，OD650控制在2。作为优选，发酵培养的温度为37℃。本专利技术提供了重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法。该重组菌株以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和敲除iclR基因。本专利技术至少具有如下有益效果之一：1、本专利技术将pntAB基因的天然启动子更换为Ptac启动子，敲除iclR基因，得到重组菌株，经发酵培养，产苏氨酸的量可达15.3g/L，糖酸转化率可达18.5％。2、本专利技术得到的重组菌株无质粒负担，构建方法简便。3、本专利技术构建得到的重组菌株在发酵培养过程中无副产物乙酸形成。生物保藏说明分类命名：大肠埃希氏菌，Escherichiacoli，于2016年11月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏中心地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.13402。具体实施方式本专利技术公开了重组菌株及其制备方法和生产L-苏氨酸的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。根据大肠杆菌中L-苏氨酸的代谢途径，本专利技术以野生型W3110为出发菌株，在其基因组上进行相关改造，对苏氨酸末端代谢途径中关键基因进行修饰，如：解除天冬氨酸激酶的反馈抑制，强化thrA*BC增强了L-苏氨酸末端合成途径、敲除tdh阻断了L-苏氨酸降解产物甘氨酸的形成，获得的基因工程菌株命名为MHZ-0213-3，其可有效积累苏氨酸，且无需添加氨基酸及无质粒负担。本专利技术在MHZ-0213-3菌株的基础上进行相关改造工作。很多工业上有用的化合物的生物合成都需要辅因子NADPH，如大肠杆菌(E.coli)生物合成番茄红素(Alper,H.等,(2005)Metab.Eng.7,155-164)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)高产赖氨酸(Ikeda.JIndMicrobiolBiotechnol.2006,33:610-615)。苏氨酸在大肠杆菌中的代谢积累同样需要足够的还原力供应。已知pntAB编码的吡啶核苷酸转氢酶利用电化学质子梯度作为驱动力，通过将NADH氧化为NAD+而把NADP+还原为NADPH，可以理解为通过强化pntAB可以提高胞内的NADPH水平。乙醛酸途径中iclR基因，其编码转录调节蛋白IclR可负调节编码异柠檬酸裂解酶和苹果酸合酶的aceBA基因的表达。大肠杆菌W3110突变菌株的构建工作，利用了JiangY等报道的文献中CRISPR-Cas9方法(MultigeneEditingintheEscherichiacoliGenomeviatheCRISPR-Cas9System,JiangY,ChenB,etal.Appl.EnvironMicrobiol,2015)进行大肠杆菌基因组上的遗传操作。以下实施例中，所述卡那霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml，所述壮观霉素在培养基中的终浓度为50μg/ml。以下实施例中，所用试剂均可由市场购得。本专利技术提供的高转化率苏氨酸生产菌种的亲代菌株为W3110，属于埃希氏菌属(Escherichia)。实施例中使用引物序列见下表。表1引物序列名称SEQIDNo.序列gRNApntABup-f11aatactagtgaagggaatatcatgcgaatgttttagagctagaaatagcgRNApntABdn-r12cgccccggcacgaatcactattcaaaaaaagcaccgactcggpntABup-f13tagtgattcgtgccggggcgPtac-pntABup-r14tgattaattgtcaac本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组菌株，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和敲除iclR基因。

【技术特征摘要】
1.一种重组菌株，其特征在于，以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和敲除iclR基因。2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述强化pntAB基因为：将pntAB基因的天然启动子更换为Ptac启动子。3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，所述出发菌株为大肠杆菌MHZ-0213-3。4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的保藏编号为CGMCCNo.13402。5.一种重组菌株的构建方法，其特征在于，包括：以大肠杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：强化pntAB基因和敲除iclR基因。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述改造采用CR...

【专利技术属性】
技术研发人员：程江红，张捧，康培，刁刘洋，毛贤军，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：河北;13