一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒制造技术

一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒，属于生物医学检验技术领域。本发明专利技术提供的检测具核梭杆菌的核酸组合能特异地检测出具核梭杆菌，利用该核酸组合制备检测粪便中具核梭杆菌的试剂盒及制备检测癌症的试剂盒，有效提高检测的精度，能方便快捷的应用于检测具核梭杆菌，具有较高的灵敏度和特异性。本发明专利技术提供的技术方法，不仅能更方便地从粪便中提取具核梭杆菌基因组，对具核梭杆菌进行定量检测，且操作简单，利于推广应用。

Nucleic acid combination for detection of pathogenic bacteria in feces and application and kit thereof

Nucleic acid combination for detecting fecal bacteria with nuclear shuttle bacillus and application thereof and kit thereof, belonging to the field of biomedical inspection technology. The present invention provides nucleic acid detection combined nucleatum can specifically detect by Fusobacterium, kit for cancer detection kit and preparation of Fusobacterium nucleatum using the nucleic acid preparation of feces, effectively improve the detection accuracy, convenient application in the detection of Fusobacterium nucleatum, has higher sensitivity and specificity. The technical method provided by the invention can not only conveniently extract the genome of the shuttle Bacillus from feces, but also has the advantages of simple operation and convenient popularization and application.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学检验
，且特别涉及一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合及其应用与试剂盒。
技术介绍
结直肠癌(Colorectalcancer，CRC)为常见多发的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率均位于全世界常见恶性肿瘤的第3位。在中国，近年结直肠癌发病率逐年上升，估计每年约有40万新发病例，目前在我国消化系统恶性肿瘤中位列第2位。早期结直肠癌患者手术5年生存率可高达90％以上，而中、晚期患者5年生存率仅10％左右，临床诊断的结肠癌约80％为中晚期，这是导致其死亡率无明显改善的关键因素之一。而有效的早期直结肠癌患者可使直结肠癌发病率降低60％，病死率降低80％，因此结直肠癌的早期发现、早期诊断及早期治疗显得尤为重要。目前，直结肠癌非侵入式检测方法用于疾病的筛查有效力非常低下，因为需要患者每年收集粪便样本便潜血试验或粪便免疫化学荧光检测，假阳性比率高，结果稳定性差，总体受检率小于3％。尽管乙状结肠镜检查或结肠镜检查检出率较高，是直结肠癌检查的金标准，但是需要患者做清理肠道准备、依靠麻醉并且侵犯隐私，患者会产生恐惧心理，检查出血或者感染等情况，总体依从性较差，受检率小于5％。因此，高特异性、高灵敏度、依从性好、非侵入式的直结肠癌早期诊断技术亟待解决。具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)是常见的革兰氏阴性无芽胞厌氧杆菌，以口腔牙垢中最为多见。2011年10月两支独立的研究团队证实具核梭杆菌也存在于肠道中，并且具核梭杆菌的丰度与结直肠癌有关。2013年哈佛医学院与凯斯西储大学证实具核梭杆菌通过诱导炎性反应、促癌信号通路开放，促进结直肠癌增殖。目前，对具核梭杆菌的应用主要集中在口腔类疾病以及常见癌症方面；也不能进行定量检测，粪便中具核梭杆菌及其具体检测方法也未见报道。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合，该核酸组合能特异的、高灵敏度检测具核梭杆菌。本专利技术的第二目的在于提供上述核酸组合在检测粪便中具核梭杆菌的应用。本专利技术的第三目的在于提供上述核酸组合在制备检测癌症的试剂盒中的应用。本专利技术的第四目的在于提供上述核酸组合在制备检测具核梭杆菌的试剂盒中的应用。本专利技术的第五目的在于提供一种检测粪便具核梭杆菌的试剂盒，该试剂盒能方便快速应用于检测粪便中具核梭杆菌，方便操作，利于推广应用。本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。本专利技术提供一种检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合，核酸组合包括引物组合和探针；引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对，第一引物对的碱基序列如SEQIDNO.1-2所示，第二引物对的碱基序列如SEQIDNO.3-4所示，第三引物对的碱基序列如SEQIDNO.5-6所示；探针包括第一探针、第二探针和第三探针，第一探针的碱基序列如SEQIDNO.7所示，第二探针的序列如SEQIDNO.8所示，第三探针的序列如SEQIDNO.9所示；探针的5'端标记有荧光基团，探针3'端标记有淬灭基团，荧光基团为FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一种，所述淬灭基团为6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂中的一种。进一步，上述第一引物对为具核梭杆菌检测引物，上游检测引物包括SEQIDNO.1所示的核苷酸序列，SEQIDNO.1所示的核苷酸序列为5’-TCTCCTTTCAATAAAAGTGGC-3’；具核梭杆菌下游检测引物包括SEQIDNO.2所示的核苷酸序列，SEQIDNO.2所示的核苷酸序列为：5’-AAGAAGTAGGATGAAAATCAGTTA-3’；进一步具核梭杆菌探针包括SEQIDNO.7所示的核苷酸序列，SEQIDNO.7所示的核苷酸序列为5’-AGACCGATGCTCTACC-3’；进一步，检测探针的5'端标记有荧光基团，检测探针的3'端标记有淬灭基团。上述探针5'端标记的荧光基团为：FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一种；其3'端标记的淬灭基团为：6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂(MinorGrooveBindernonfluorescentquencher,MGBNFQ)中的一种。优选地，荧光标记物选择FAM，淬灭剂选择MGB。进一步，第二引物对和第二探针为内参(Internalreference,IR)引物对和内参探针；内参引物对包括内参上游引物和内参下游引物，为用于扩增细菌的16SrDNA基因；内参IR上游引物的核苷酸序列SEQIDNO.3所示，SEQIDNO.3的核苷酸序列为5’-CCTGGACGAAGACTGACGCTC-3’；内参IR上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示，SEQIDNO.4的核苷酸序列为5’-CTCAAGGGCACAACCTCCAAG-3’；内参IR探针的核苷酸序列SEQIDNO.8所示，SEQIDNO.8所示的核苷酸序列为5’-CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG-3’；上述内参IR探针在其5'端的标记的荧光基团为：FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中一种，3'端标记的淬灭基团为：6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂(MinorGrooveBindernonfluorescentquencher,MGBNFQ)中的一种。优选地，荧光标记物选择NED，淬灭剂选择BHQ-2。第三引物对和第三探针为过程控制对照基因(processingcontrol，PC)引物对和过程控制对照基因PC探针；其目的是监控从核酸提取到扩增的整个检测过程。PC引物对包括PC上游引物和PC下游引物，为用于扩增枯草芽孢杆菌的基因；PC上游引物的核苷酸序列SEQIDNO.5所示，SEQIDNO.5所示的核苷酸序列为5’-GATGAATATCCGCATCTACC-3’；PC下游引物的核苷酸序列SEQIDNO.6所示，SEQIDNO.6所示的核苷酸序列为5’-TTTGGCGGATCAGGTTTTTC-3’；PC探针的核苷酸序列SEQIDNO.9所示，SEQIDNO.9所示的核苷酸序列为5’-CACGCCATTCAGATTCCGACGGATCT-3’；上述PC探针的5'端标记的荧光基团为：FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一种；3'端标记的淬灭基团为：6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂(MinorGrooveBindernonfluorescentquencher,MGBNFQ)中的一种。优选地，荧光基团选择VIC，淬灭基团选择BHQ-2。提供上述核酸组合在检测粪便中具核梭杆菌的应用。提供上述核酸组合在制备检测癌症的试剂盒中的应用。提供上述核酸组合在制备检测具核梭杆菌试剂盒中的应用。本专利技术还提供一种用于检测粪便中具核梭杆菌试剂盒，包括上述的检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合。与现有技术相比本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括引物组合和探针；所述引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对，所述第一引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1‑2所示，所述第二引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3‑4所示，所述第三引物对的碱基序列如SEQ ID NO.5‑6所示；所述探针包括第一探针、第二探针和第三探针；所述第一探针的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，所述第二探针的序列如SEQ ID NO.8所示，所述第三探针的序列如SEQ ID NO.9所示；所述探针的5'端标记有荧光基团，所述探针3'端标记有淬灭基团，所述荧光基团为FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一种，所述淬灭基团为6‑TAMRA、BHQ‑1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂中的一种。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测粪便中具核梭杆菌的核酸组合，其特征在于，所述核酸组合包括引物组合和探针；所述引物组合包括第一引物对、第二引物对和第三引物对，所述第一引物对的碱基序列如SEQIDNO.1-2所示，所述第二引物对的碱基序列如SEQIDNO.3-4所示，所述第三引物对的碱基序列如SEQIDNO.5-6所示；所述探针包括第一探针、第二探针和第三探针；所述第一探针的碱基序列如SEQIDNO.7所示，所述第二探针的序列如SEQIDNO.8所示，所述第三探针的序列如SEQIDNO.9所示；所述探针的5'端标记有荧光基团，所述探针3'端标记有淬灭基团，所述荧光基团为FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、ROX、RED610、TEXASRED、RED670、NED中的一种，所述淬灭基团为6-TAMRA、BHQ-1～3、和结合分子沟的非荧光淬灭剂中的一种。2.如权利要求1所述的核酸组合在检测粪便中具核梭杆菌的应用。3.如权利要求1所述的核酸组合在制备癌症早期检测的试剂盒中的应用。4.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：张良禄，董兰兰，姚希辉，
申请(专利权)人：武汉艾米森生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42