一种HPV16型E7蛋白的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及一种HPV16型E7蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括：包被有HPV16型E7抗体的化学发光板：化学发光板的每个微孔内抗体的包被量为0.05～0.5μg；HRP标记的HPV16型E7抗体：浓度为0.05～0.4μg/ml。本发明专利技术直接检测高危型HPV相关致癌蛋白的表达与否以及表达量，从而对于高危型HPV的感染程度有了明确的判断，方便了后续的治疗。

Detection kit for HPV16 type E7 protein

The detection kit of the invention relates to a HPV16 type E7 protein, the kit comprises a HPV16 type E7 antibody by chemical luminescence plate: each cell chemiluminescence sheet in the antibody coated amount is 0.05 to 0.5 mu g; HPV16 type E7 antibody labeled with HRP: the concentration of 0.05 ~ 0.4 g/ml. The present invention directly detects the expression and expression of high risk HPV related oncogenic protein and the expression quantity, so as to determine the infection degree of high risk type HPV, which is convenient for subsequent treatment.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测试剂盒，特别涉及一种HPV16型E7蛋白的检测试剂盒。
技术介绍
宫颈癌是在女性中第二常见的癌症诊断，并且在99.7％的情况下与高危人乳头瘤病毒感染相关，全世界每年有约400000例宫颈癌，近200000人死亡。HPV有超过100种不同的分离株，已根据它们与宫颈癌或与良性宫颈病变或非典型增生的关联性被宽泛地再分成高危和低危亚型。低危险型HPV包括HPV6、11、42、43、44等，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内低度病变(CINI)，高危险型HPV包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68，CP8304等亚型，与宫颈癌及宫颈上皮内高度病变(CINII/III)的发生相关，尤其是HPV16和18型，其中HPV16占50％以上。人乳头瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)是一种嗜上皮性病毒，共有3个基因区组成，包括早期区(EarlyRegion，E区)、晚期区(LateRegion，L区)与非编码区(UncodingRegion，UCR)或上游调控区(URR)。E区按顺序为E6、E7、E1、E2、E3、E4和E5共7个基因，参与病毒DNA的复制、转录、编码病毒蛋白、维持细胞内病毒的高拷贝数的基因，其中E6和E7是HPV的主要致癌基因，与病毒细胞转化功能及致癌性有关。E6和E7蛋白使肿瘤阻抑蛋白p53和pRB钝化，分别解除细胞周期控制和抑制细胞凋亡。因此，用于测定肿瘤中的HPV状态的最佳方法是测量肿瘤细胞中的E6/E7蛋白。目前人乳头瘤病毒(HPV)的主要检测方法包括原位杂交，DNA直接捕捉法和各类PCR方法。上世纪90年代中期在传统的PCR基础上发展起来的实时荧光定量PCR(qPCR,Real-timeQuantitativePCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点成为了分子诊断研究中的重要工具。但是上述方法只是在基因水平上检测是否感染了人乳头瘤病毒(HPV)，至于相关致癌蛋白的表达与否，实时荧光定量PCR技术并不能给出准确的判断，而且该方法需要配套仪器实时荧光定量PCR仪，价格昂贵，检测成本高。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供了用于检测高危型人乳头瘤病毒(HPV)16亚型E7致癌蛋白的化学发光检测试剂盒。宫颈脱落细胞裂解后直接加样，直接检测高危型HPV相关致癌蛋白的表达与否以及表达量，从而对于高危型HPV的感染程度有了明确的判断，方便了后续的治疗。这一点恰恰正是目前检测方法(包括实时荧光定量PCR技术)不能媲美的。本专利技术试剂盒采用双抗体夹心法，使用抗体检测人体宫颈脱落细胞中的高危型HPV16型E7蛋白。先将宫颈脱落细胞裂解后，直接加入包被了特异性抗体的化学发光板中，经温育和洗涤后，加入酶标抗体，再经温育和洗涤后加入底物，用化学发光仪检测发光值。发光值与E7蛋白含量呈正相关，由此实现对人体宫颈脱落细胞中的HPV16型E7蛋白的定量检测。本专利技术采用的技术方案为：本专利技术提供了一种HPV16型E7蛋白检测的化学发光板，该化学发光板包被有HPV16型E7抗体。优选地，该化学发光板的每个微孔内抗体的包被量为0.05～0.5μg。优选地，所述化学发光板的制备方法，包括如下步骤：取HPV16型E7抗体，按100μL/孔将包被液(包被液：抗体0.5～5mg加入包被缓冲液1000ml；包被缓冲液：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔内，4℃过夜(16～18h)；采用洗涤液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)进行洗涤，300μL/孔，洗涤五次；按300μl/孔往微孔中加入封闭液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L)，37℃放置1～2h进行封闭；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗体的微孔板，干燥保存。本专利技术还提供了一种HPV16型E7蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括：包被有HPV16型E7抗体的化学发光板：化学发光板的每个微孔内抗体的包被量为0.05～0.5μg；HRP标记的HPV16型E7抗体：浓度为0.05～0.4μg/ml。进一步，所述的试剂盒还包括人体宫颈脱落细胞裂解液。优选地，所述的人体宫颈脱落细胞裂解液包括：0.05％～1％(体积百分比)表面活性剂；10mM～1M缓冲液；1mM～10mM蛋白酶抑制剂。(结合多次冻融可达到更加理想的裂解效果)更优选地，所述的表面活性剂为Tween20，Triton-100或十二烷基磺酸钠中的一种或两种以上。所述的缓冲液为phosphate-bufferedsaline，Tris-HCL或碳酸盐溶液，所述的蛋白酶抑制剂为cystatin，PMSF或Antipain中的一种或两种以上。更优选地，所述的人体宫颈脱落细胞裂解液由包括如下步骤的方法制备得到：用10mM～1M缓冲液配置0.05％～1％(体积百分比)表面活性剂；用之前加入终浓度为1mM～10mM蛋白酶抑制剂。更优选地，所述的人体宫颈脱落细胞裂解液由包括如下步骤的方法制备得到：用50mMPBS溶液配置1％Tween20；用之前加入终浓度为5mM蛋白酶抑制剂PMSF。进一步，所述的包被有HPV16型E7抗体的化学发光板的制备方法，包括如下步骤：取HPV16型E7抗体，按100μL/孔将包被液(包被液：抗体0.5～5mg加入包被缓冲液1000ml；包被缓冲液：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔内，4℃过夜(16～18h)；采用洗涤液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)进行洗涤，300μL/孔，洗涤五次；按300μl/孔往微孔中加入封闭液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L)，37℃放置1～2h进行封闭；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗体的微孔板，干燥保存。具体地，该试剂盒的主要组成成分如下：①上述包被有HPV16型E7抗体的化学发光板：每个微孔内抗体的包被量为0.05～0.5μg，条形微孔板(12条×8孔)，置于框架中；②HPV16型E7蛋白校准品0、1、2、3、4、5：校准品为冻干粉，分别加入1mlddH2O溶解，校准品溶液的线性浓度分别为0、10、20、40、80、160ng/ml；③HPV16型E7蛋白质控品1、2：质控品为冻干粉，加入1mlddH2O溶解，浓度分别为10和80ng\本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种HPV16型E7蛋白检测的化学发光板，其特征在于：该化学发光板包被有HPV16型E7抗体。

【技术特征摘要】
1.一种HPV16型E7蛋白检测的化学发光板，其特征在于：该化学发光板包被有HPV16型E7抗体。2.根据权利要求1所述的一种HPV16型E7蛋白检测的化学发光板，其特征在于：该化学发光板的每个微孔内抗体的包被量为0.05～0.5μg。3.权利要求1或2所述化学发光板的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：取HPV16型E7抗体，按100μL/孔将包被液(包被液：抗体0.5～5mg加入包被缓冲液1000ml；包被缓冲液：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔内，4℃过夜(16～18h)；采用洗涤液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin3000.3ml/L)进行洗涤，300μL/孔，洗涤五次；按300μl/孔往微孔中加入封闭液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、BSA10g/L、sucrose25g/L、proclin3000.3ml/L)，37℃放置1～2h进行封闭；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗体的微孔板，干燥保存。4.一种HPV16型E7蛋白的检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：包被有HPV16型E7抗体的化学发光板：化学发光板的每个微孔内抗体的包被量为0.05～0.5μg；HRP标记的HPV16型E7抗体：浓度为0.05～0.4μg/ml。5.根据权利要求4所述的HPV16型E7蛋白的检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括人体宫颈脱落细胞裂解液。6.根据权利要求5所述的HPV16型E7蛋白的检测试剂盒，其特征在于：所述的人体宫颈脱落细胞裂解液包括：0.05％～1％表面活性剂；10mM～1M缓冲液；1mM～10mM蛋白酶抑制剂。7.根据权利要求6所述的HPV16型E7蛋白的检测试剂盒，其特征在于：所述的表面活性剂为Tween20，Triton-100或十二烷基磺酸钠中的一种或两种以上；所述的缓冲液为phosphate-bufferedsaline，Tris-HCL或碳酸盐溶液，所述的蛋白酶抑制剂为cystatin，PMSF或Antipain中的一种或两种以上。8.根据权利要求4-7任一项所述的HPV16型E7蛋白的检测试剂盒，其特征在于：所述的包被有HPV16型E7抗体的化学发光板的制备方法，包括如下步骤：取HPV16型E7抗体，按100μL/孔将包被液(包被液：抗体0.5～5mg加入包被缓冲液1000ml；包被缓冲液：Na2CO31.59g/L，NaHCO32.93g/L)加入微孔内，4℃过夜(16～18h)；采用洗涤液(Na2HPO41.44g/L、KH2PO40.24g/L、NaCl8g/L、KCl0.2g/L、Tween-200.5...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗进超，
申请(专利权)人：弗雷米德生物医药技术天津有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12