人碱性磷酸酶糖蛋白的癌细胞高效表达系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了一种人骨肉瘤细胞系MG‑63在外源表达人碱性磷酸酶糖蛋白中的应用，以及rhALP的外源表达方法，包括如下步骤：(1)构建含有rhALP的重组质粒；(2)将重组质粒整合至人骨肉瘤MG‑63细胞内，获得能够表达rhALP的人骨肉瘤MG‑63细胞；(3)培养上述能够表达rhALP的人骨肉瘤MG‑63细胞，提取目的蛋白。本发明专利技术利用癌细胞MG‑63快速增殖及糖基化修饰系统的特性，通过基因工程技术利用人源癌细胞表达重组人碱性磷酸酶rhALP。本发明专利技术构建rhALP的重组表达载体，筛选能高效表达rhALP的MG‑63细胞；纯化并检测重组rhALP的糖基化状态及其生物学活性。重组rhALP的表达量和活性得到了极大的提高。

High expression system of human alkaline phosphatase glycoprotein cancer cell and application thereof

The invention discloses a MG human osteosarcoma cell line 63 in the application of exogenous expression of glycoprotein in human alkaline phosphatase, and rhALP expression method, which comprises the following steps: (1) to construct a recombinant plasmid containing rhALP; (2) the recombinant plasmid into human osteosarcoma MG 63 cells obtained expression of rhALP in human osteosarcoma MG cells 63; (3) the expression of rhALP to cultured human osteosarcoma MG cells 63, protein extraction. The invention utilizes characteristics of cancer cells MG 63 rapid proliferation and glycosylation system, through gene engineering using human cancer cells expressing recombinant human alkaline phosphatase rhALP. The construction of rhALP recombinant expression vector, screening of effective expression of rhALP MG 63 cell; glycosylation status and biological activity detection and purification of recombinant rhALP. The expression and activity of recombinant rhALP were greatly improved.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种人碱性磷酸酶糖蛋白的癌细胞高效表达系统及其应用。
技术介绍
碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，ALP)是一种磷酸单酯酶，通过磷脂酰肌醇聚糖定位于细胞膜上可以水解细胞外基质中的磷酸代谢底物，分离出无机磷，促进形成矿化结晶。ALP基因突变导致血清及骨组织中ALP活性下降而造成的骨骼及牙齿发育缺陷及矿化异常。有报道利用ALP重组蛋白治疗模式小鼠的低碱性磷酸酯酶症取得了成功，并且在临床试验中对重症低碱性磷酸酯酶症患者治疗也获得了满意的效果。人组织非特异性碱性磷酸酶(hALP)在基因组中跨度约50kb，共有12个外显子，编码524个氨基酸。hALP是一种二聚体糖蛋白，在其二聚体形式时具有生物学活性，单体或无糖基化的碱性磷酸酶没有生物活性或生物活性很低。目前蛋白表达系统主要有原核表达系统、酵母表达系统、植物表达系统、昆虫表达系统及哺乳动物表达系统。用原核系统大肠杆菌表达的人碱性磷酸酶生物活性很低，而且不稳定，这可能是由于原核表达系统缺乏翻译后修饰功能。毕赤酵母虽然具有翻译后修饰功能，但糖基化形式与人类存在差异且只能表达单体形式的人碱性磷酸酶。昆虫及植物表达系统虽具有负责的蛋白翻译后加工修饰系统，但是考虑到其糖基化差异的问题，也不适合表达应用于临床治疗的人碱性磷酸酶。研究表明哺乳动物CHO细胞表达的人碱性磷酸酶是二硫键连接的成熟的二聚体，具有生物学活性，有效地降低过剩焦磷酸无机(PPi)和恢复正常的矿化作用，但是表达量的水平较低。综上，现有的rhALP的外源表达技术尚不成熟，仍存在产量低、活性低、成本高等问题，不能满足市场需求。因此，开发新的rhALP外源表达方法具有十分重要的意义。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一种人碱性磷酸酶糖蛋白的癌细胞高效表达系统及其应用。本专利技术中所称的人碱性磷酸酶糖蛋白即为重组人组织非特异性碱性磷酸酶(rhALP)。为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：本专利技术的第一方面，提供人骨肉瘤细胞系MG-63在外源表达人碱性磷酸酶糖蛋白中的应用。上述应用中，人骨肉瘤细胞系MG-63作为人碱性磷酸酶糖蛋白的表达系统。人骨肉瘤细胞系MG-63源自患者的骨肉瘤，与一般的癌细胞不同，在MG-63中未检测到SV40，RSV或腺病毒等病毒，在免疫抑制小鼠中不致瘤，具有较高的安全性；而且，MG-63还具有快速增殖及糖基化修饰系统的特性，因此，本专利技术选择人骨肉瘤细胞系MG-63作为人碱性磷酸酶糖蛋白的表达系统，用于外源表达人碱性磷酸酶糖蛋白。本专利技术的第二方面，提供一种rhALP的外源表达方法，包括如下步骤：(1)构建含有rhALP的重组质粒；(2)将重组质粒整合至人骨肉瘤MG-63细胞内，获得能够表达rhALP的人骨肉瘤MG-63细胞；(3)培养上述能够表达rhALP的人骨肉瘤MG-63细胞，提取目的蛋白。步骤(1)中，所述重组质粒的构建方法为：设计合成rhALP基因片段，克隆至真核表达载体pcDNA3.1中，即构建得到含有rhALP的重组质粒。优选的，上述设计合成的rhALP基因片段的5’端添加HindIII酶切位点，3’端添加XhoI酶切位点。进一步优选的，所述rhALP基因片段的序列如SEQIDNO.1所示。步骤(2)中，所述整合采用的方法为质粒转染，具体如下：利用Lipofectamine2000转染MG-63，转染后利用400μg/mL的G418筛选稳定转染rhALP的MG-63细胞。步骤(3)中，提取目的蛋白的方法为：裂解能够表达rhALP的人骨肉瘤MG-63细胞，离心，弃去细胞碎片，收集离心上清。上述方法表达的rhALP也是本专利技术的保护范围，所述rhALP的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的有益效果：(1)与一般在癌细胞中表达蛋白，研究其癌细胞迁移和侵袭转移的影响不同，本专利技术在蛋白表达体系选择过程中，充分考虑了表达体系对重组蛋白的表达量、活性、以及安全性和稳定性的影响。研究结果表明：本专利技术采用的MG-63表达系统具有快速增殖及高效的翻译后修饰系统的特性，能够高效表达高活性的rhALP；而且在MG-63表达系统中未检测到SV40，RSV或腺病毒等病毒，具有较高的安全性，提供了一种新的rhALP外源表达系统，为大规模制备碱性磷酸酶奠定了基础。另外，MG-63虽然属于人骨肉瘤细胞系，但人骨肉瘤细胞系的种类众多，功能各异，并非所有的人骨肉瘤细胞系都可以用于作为蛋白表达系统；而且目前对于MG-63的研究主要集中于如何抑制MG-63的增殖与转移，本专利技术系首次提出利用MG-63作为蛋白表达系统外源表达高活性的rhALP。(2)针对二聚体糖蛋白rhALP在外源表达过程中所存在的产量低、活性低等问题，本专利技术利用癌细胞MG-63快速增殖及糖基化修饰系统的特性，通过基因工程技术利用人源癌细胞表达重组人碱性磷酸酶rhALP。本专利技术构建rhALP的重组表达载体，筛选能高效表达rhALP的MG-63细胞；纯化并检测重组rhALP的糖基化状态及其生物学活性，重组rhALP的表达量和活性得到了极大的提高。附图说明图1：重组质粒rhALP-pcDNA3.1构建流程图；图2：人骨肉瘤MG-63细胞表达的rhALP蛋白的westernblot验证图；图3：ALP糖基化检测结果。具体实施方式结合实施例对本专利技术作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本专利技术，并不对其内容进行限定。本专利技术实施例中所用到的试剂、酶、表达载体等均为现有技术中的常规产品。实施例1：rhALP的外源表达方法具体方法如下：1.重组质粒的构建：(1)目的基因片段的设计与合成：在ALP成熟肽基因序列5’端添加HindIII酶切位点，ALP成熟肽基因序列3’端添加XhoI酶切位点。设计后的人ALP基因(rhALP)序列合成，设计后的rhALP基因序列如下：AAGCTTATGTTAGTGCCAGAGAAAGAGAAAGACCCCAAGTACTGGCGAGACCAAGCGCAAGAGACACTGAAATATGCCCTGGAGCTTCAGAAGCTCAACACCAACGTGGCTAAGAATGTCATCATGTTCCTGGGAGATGGGATGGGTGTCTCCACAGTGACGGCTGCCCGCATCCTCAAGGGTCAGCTCCACCACAACCCTGGGGAGGAGACCAGGCTGGAGATGGACAAGTTCCCCTTCGTGGCCCTCTCCAAGACGTACAACACCAATGCCCAGGTCCCTGACAGTGCCGGCACCGCCACCGCCTACCTGTGTGGGGTGAAGGCCAATGAGGGCACCGTGGGGGTAAGCGCAGCCACTGAGCGTTCCCGGTGCAACACCACCCAGGGGAACGAGGTCACCTCCATCCTGCGCTGGGCCAAGGACGCTGGGAAATCTGTGGGCATTGTGACCACCACGAGAGTGAACCATGCCACCCCCAGCGCCGCCTACGCCCACTCGGCTGACCGGGACTGGTACTCAGACAACGAGATGCCCCCTGAGGCCTTGAGCCAGGGCTGTAAGGAC本文档来自技高网...

【技术保护点】
人骨肉瘤细胞系MG‑63在外源表达人碱性磷酸酶糖蛋白中的应用。

【技术特征摘要】
1.人骨肉瘤细胞系MG-63在外源表达人碱性磷酸酶糖蛋白中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，人骨肉瘤细胞系MG-63作为人碱性磷酸酶糖蛋白的表达系统。3.一种rhALP的外源表达方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)构建含有rhALP的重组质粒；(2)将重组质粒整合至人骨肉瘤MG-63细胞内，获得能够表达rhALP的人骨肉瘤MG-63细胞；(3)培养上述能够表达rhALP的人骨肉瘤MG-63细胞，提取目的蛋白。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述重组质粒的构建方法为：设计合成rhALP基因片段，克隆至真核表达载体pcDNA3.1中，即构建...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹广祥，付加芳，马军霞，王志宇，宗工理，王世立，
申请(专利权)人：山东省医药生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37