一种DNA分子及其在生产鲑鱼降钙素中应用制造技术

本发明专利技术公开了一种DNA分子及其在生产鲑鱼降钙素中应用。本发明专利技术所提供的DNA分子为序列表中序列1自5′末端起第22至120位核苷酸所示的DNA分子。实验证明，将该DNA分子插入出发质粒，得到的重组质粒转化油菜品种中双4号，得到转基因植物；待转基因植物成熟后收集种子，然后进行繁育和PCR检测，直至获得纯合种子。每10g纯合种子可产生0.2mg鲑鱼降钙素。可见，本发明专利技术所提供的DNA分子可用于生产鲑鱼降钙素，具有重要的应用价值。

DNA molecule and its application in production of salmon calcitonin

The present invention discloses a kind of DNA molecule and its application in the production of salmon calcitonin. The DNA molecule provided by the present invention is a DNA molecule of twenty-second to 120 nucleotides at the end of sequence 1 in the sequence table from the beginning to the end of 5. Experiments show that the DNA molecules are inserted into the starting plasmid, recombinant plasmid was transformed into rapeseed cultivar Zhongshuang 4, get transgenic plants; to mature transgenic plants after seeds were collected, and then breeding and PCR detection, to obtain homozygous seeds. Each 10g homozygous seed can produce 0.2mg salmon calcitonin. Therefore, the DNA molecule can be used for the production of salmon calcitonin, which has important application value.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种DNA分子及其在生产鲑鱼降钙素中应用。
技术介绍
鲑鱼降钙素是由鲑鱼后腮体分泌的由32个氨基酸组成的单链多肽。鲑鱼降钙素作为治疗骨质疏松症等代谢性骨病的防治药已被载入多国药典，并已在多国行销近30年。鲑鱼降钙素具有调节体内钙、磷代谢及骨骼代谢的重要生物学功能，可降低血钙水平，还具有抗组胺、抗胆碱、抑制胃酸和胰腺分泌的作用。临床上主要用于治疗骨质疏松症。鲑鱼降钙素的生产方法主要有提取法、化学合成法和基因工程法。提取法是以鲑鱼、鳗鱼的鳃为原料，提取获得天然鲑鱼降钙素(生物学活性达到4500U/mg)，但由于原料有限，因此获得的天然鲑鱼降钙素极少。基因工程法是在大肠杆菌或酵母中表达鲑鱼降钙素，但由于鲑鱼降钙素C端第32位氨基酸不能酰胺化，因此表达出的鲑鱼降钙素的生物学活性，仅为100-200U/mg。迄今为止，商业化销售的鲑鱼降钙素都是采用化学合成法生产的，化学合成法步骤多、得率低且价格昂贵，注射针剂中的鲑鱼降钙素为12000元/mg，原药价格也高达18000-20000元/g。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是如何制备鲑鱼降钙素。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种DNA分子。本专利技术所提供的DNA分子，可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：b1)具有序列表中序列1自5′末端起第22至120位核苷酸所示的DNA分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第22至120位所示的DNA分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有85％或85％以上同一性，且编码鲑鱼降钙素的前体的DNA分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述鲑鱼降钙素的前体的DNA分子。所述鲑鱼降钙素的前体可为氨基酸序列如序列表中序列5自N末端起第158至190位所示的蛋白质。含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体可为将所述DNA分子插入出发质粒，得到的重组质粒。所述重组载体具体可为重组质粒pBO-sCT2301。所述重组质粒pBO-sCT2301为将载体pCAMBIA2301的限制性内切酶HindⅢ和EcoRI识别序列间的小片段替换为序列表中序列4所示的DNA分子，得到的重组质粒。所述重组质粒pBO-sCT2301表达序列表中序列5所示的蛋白质。所述重组载体具体可为重组质粒pBO-sCT2301-DZ。所述重组质粒pBO-sCT2301和所述重组质粒pBO-sCT2301-DZ的唯一不同在于：所述重组质粒pBO-sCT2301中鲑鱼降钙素的前体的编码基因(即sCT基因)为序列表中序列4自5′末端起第1363至1461位所示，所述重组质粒pBO-sCT2301-DZ中鲑鱼降钙素的前体的编码基因(即sCT-DZ基因)为序列表中序列7自5′末端起第22至120位所示。所述重组质粒pBO-sCT2301-DZ表达序列表中序列5所示的蛋白质。所述重组微生物可为将所述重组载体导入出发微生物得到的重组菌。所述出发微生物可为根癌农杆菌。所述根癌农杆菌具体可为根癌农杆菌LBA4404。所述重组微生物具体可为LBA4404/pBO-sCT2301。所述LBA4404/pBO-sCT2301为采用电击法将重组质粒pBO-sCT2301导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌。所述重组微生物具体可为LBA4404/pBO-sCT2301-DZ。所述LBA4404/pBO-sCT2301-DZ为采用电击法将重组质粒pBO-sCT2301-DZ导入根癌农杆菌LBA4404，得到重组农杆菌。为解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种培育转基因植物的方法。本专利技术所提供方法，是将所述DNA分子导入受体植物，得到转基因植物；所述转基因植物可以生产鲑鱼降钙素和/或鲑鱼降钙素的前体。上述方法中，所述受体植物可为油菜品种中双4号。上述方法中，所述“将所述DNA分子导入受体植物”是通过将上述任一所述重组载体导入受体植物实现的。所述DNA分子，或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在生产所述鲑鱼降钙素的前体中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述DNA分子，或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在制备用于生产所述鲑鱼降钙素的前体的产品中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述DNA分子，或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在生产鲑鱼降钙素中应用也属于本专利技术的保护范围。所述DNA分子，或含有所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系在制备用于生产鲑鱼降钙素的产品中的应用也属于本专利技术的保护范围。所述鲑鱼降钙素的前体在植物体内可自发形成鲑鱼降钙素。实验证明，将本专利技术所提供DNA分子的插入出发质粒，得到的重组质粒转化油菜品种中双4号，得到转基因植物；待转基因植物成熟后收集种子，然后进行繁育和PCR检测，直至获得纯合种子。每10g纯合种子可产生0.2mg鲑鱼降钙素。可见，本专利技术所提供的DNA分子可用于生产鲑鱼降钙素，具有重要的应用价值。附图说明图1为实施例1步骤二中6的实验结果。图2为实施例1步骤二中7的实验结果。图3为实施例1步骤二中7的实验结果。图4为实施例1步骤二中7的实验结果。图5为实施例1步骤二8中(1)的实验结果。图6为实施例1步骤二8中(2)的实验结果。图7为实施例1中步骤三的实验结果。图8为实施例1中步骤四的实验结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。油菜品种中双4号记载于如下文献中：罗晓辉，叶明海.“中双4号”育苗移栽高产栽培[J].上海农业科技，1999年05期.在下文中，油菜品种中双4号简称中双4号。油菜品种青油14号记载于如下文献中：苏有志.甘蓝型春油菜新品种—青油14号[J].中国农技推广，1997年03期.在下文中，油菜品种青油14号简称青油14号。豫芝4号记载于如下文献中：曹玉平.豫芝4号.农业科技通讯，1991年11期.芝麻油体蛋白的GenBank号为AAB58402.1。油菜油体蛋白的GenBank号为X94225.1。下述实施例中的光暗交替培养(即光照培养和暗培养交替)的条件为：25℃。光照培养时的光照强度为15000Lx。光暗交替培养的周期具体为：14h光照培养/10h黑暗培养。MS0培养基：将NH4NO31650mg、KNO31900mg、KH2PO4170mg、MgSO4·7H2O370mg、CaCl2·2H2O440mg、FeSO4·7H2O27.80mg、Na2EDTA37.30mg、MnSO4·4H2O22.30mg、ZnSO4·7H2O8.60mg、H3BO36.20mg、KI0.83mg、Na2MOO4·2H2O0.25mg、CuSO4·5H2O0.025mg、COCl2·6H2O0.025mg、肌醇100.00mg、VB10.1mg、VB60.5mg、烟酸0.5mg本文档来自技高网...

【技术保护点】
DNA分子，为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：b1)具有序列表中序列1自5′末端起第22至120位核苷酸所示的DNA分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第22至120位所示的DNA分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有85％或85％以上同一性，且编码鲑鱼降钙素的前体的DNA分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述鲑鱼降钙素的前体的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.DNA分子，为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：b1)具有序列表中序列1自5′末端起第22至120位核苷酸所示的DNA分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第22至120位所示的DNA分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有85％或85％以上同一性，且编码鲑鱼降钙素的前体的DNA分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述鲑鱼降钙素的前体的DNA分子。2.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求1所述DNA分子插入出发质粒，得到的重组质粒。4.如权利要求2所述的重组微生物，其特征在于：所述重组微生物为将权利要求3所述重组载体导入出发微生物得到的重组菌。5.一种培育转基因植物的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘昱辉，李梅，贾士荣，王志兴，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11