CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体及其构建方法和应用，属于肿瘤免疫治疗领域。本发明专利技术CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体包含抗人GPC3单克隆抗体的可变区基因序列、CD16A的抗体基因序列、真核表达必须序列和linker序列；将上述序列连接在一起后装入慢病毒过表达质粒载体的位点，即得本发明专利技术CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体。本发明专利技术进一步用所述的双抗慢病毒表达载体制备得到了高效表达CD16A/GPC3双抗的NK细胞。本发明专利技术所制备的NK细胞能有效杀灭肝癌细胞、抑制肝癌肿瘤体积增加的能力、延长肝癌患者的生存期，对于肝癌治疗具有重要的意义。

CD16A/GPC3 double anti Lentivirus Expression Vector, construction method and application thereof

The invention discloses a CD16A/GPC3 double anti Lentivirus Expression Vector and a construction method and application thereof, belonging to the field of tumor immunotherapy. The invention of CD16A/GPC3 double antibody lentiviral vector containing anti human GPC3 monoclonal antibody variable region gene sequence, CD16A antibody gene, eukaryotic expression must be sequences and linker sequences; the sequence together into the lentivirus expression vector locus, the invention can be obtained by CD16A/GPC3 double antibody lentiviral expression vector. The invention further uses the double anti Lentivirus Expression Vector to prepare NK cells with high expression of CD16A/GPC3 double resistance. The NK cells prepared by the invention can effectively kill the hepatoma cells, inhibit the increase of tumor volume of liver cancer, prolong the survival time of patients with liver cancer, and has important significance for the treatment of liver cancer.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体，尤其涉及CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体的构建方法，本专利技术进一步涉及所述慢病毒载体在治疗肝癌的应用，属于肿瘤免疫治疗领域。
技术介绍
目前对于癌症治疗，主要采用了手术、放疗和化疗等多种治疗方法。然而，在特定的癌症和患者的情况下，有些治疗方法难以应用而且癌症复发的可能性很大。肝细胞癌(HCC)是世界第五大最常见癌症和第三大最常见癌症死亡原因。目前，手术是HCC最有效的治疗方法。然而，根治性肝脏切除术后肿瘤的复发率很高，5年生存率只有10％。此外，因为大多数的HCC患者是在疾病后期阶段才被诊断，因此根治性治疗，包括化疗、化疗栓塞、切除和质子束疗法，通常可能是无效的。免疫治疗联合传统的肿瘤治疗是今后提高肿瘤治疗效果的重要研究和应用方向。因此，利用患者的免疫功能的肿瘤免疫疗日益受到关注，肿瘤免疫治疗是应用现代生物技术及其产品进行肿瘤防治的新疗法，基于通过具有各种功能的免疫细胞之间的复杂的相互作用来去除肿瘤。这些免疫细胞主要包括自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK)和细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，将抗原呈递至这些效应细胞的免疫细胞包括树突细胞(DC)或B细胞。其他实例包括分泌各种细胞因子的辅助性T细胞(Th细胞)、调节性T细胞(Treg细胞)等。在这些免疫细胞中，NK细胞是最快速起效且高效的免疫细胞。NK细胞是一群不同于T、B淋巴细胞的大颗粒淋巴细胞。由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤细胞。其主要来源于骨髓CD34+的淋巴细胞，具有识别与溶解肿瘤细胞和产生免疫调节性细胞因子两大主要功能，是人体抗感染和防止细胞恶性转化的重要免疫调节细胞。抗体依赖性细胞毒性(ADCC)是抗体的一种重要的效应功能。当抗体与肿瘤细胞结合以后，抗体的Fc端可通过Fc受体(CD16A)与NK细胞结合并激活NK细胞，后者通过释放颗粒酶及穿孔素将靶细胞杀死。GPC3是硫酸乙酰肝素(HS)蛋白聚糖glypican家族的一员，可通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚，附着在细胞表面。GPC3在细胞生长、分化和迁移过程中发挥重要的作用。有多项研究表明，GPC3是一种有吸引力的肝癌特异性靶标，因为它在肝细胞癌中高表达，但是在正常组织中表达有限。因此，构建CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体，应用于制备治疗肝癌的药剂或药物，有效地消除HCC细胞，为HCC提供了一种很有前途的治疗手段。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体及携带该慢病毒载体的NK细胞；本专利技术的目的之二是提供上述慢病毒载体和NK细胞的构建方法；本专利技术的目的之三是将上述慢病毒载体和NK细胞应用于治疗肝癌的试剂或药物中；本专利技术达到上述目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术首先提供了一种CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体，由IgG的前导序列基因，抗CD16AVL基因，第一链接linker，抗GPC3VH基因，第二链接linker，抗GPC3VL基因，第三链接linker，抗CD16AVH基因，铰链序列基因，hIgG1CH2基因以及hIgG1CH3基因依次连接在一起后装入到慢病毒过表达质粒载体的位点，即得。其中，IgG的前导序列基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.1所示；抗CD16AVL基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.2所示；第一链接linker所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.3所示；抗GPC3VH基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.4所示；第二链接linker所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.5所示；抗GPC3VL基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.6所示；第三链接linker所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.7所示；抗CD16AVH基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.8所示；铰链序列基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.9所示；hIgG1CH2基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.10所示；hIgG1CH3基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.11所示。本专利技术进一步提供了一种慢病毒基因表达系统，包含：上述慢病毒过表达载体质粒、慢病毒穿梭质粒和慢病毒辅助质粒。本专利技术还公开了所述CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体的构建方法，包括：将IgG的前导基因，抗CD16AVL基因，第一链接linker，抗GPC3VH基因，第二链接linker，抗GPC3VL基因，第三链接linker，抗CD16AVH基因，铰链序列基因，hIgG1CH2基因以及hIgG1CH3基因依次连接在一起后得到融合基因；将融合基因插入到慢病毒过表达质粒载体的位点，即得。优选的，将融合基因插入到慢病毒过表达质粒载体pGreenPuroTM的XbaI/DraIII位点。本专利技术进一步提供了携带上述慢病毒表达载体的细胞，优选的为免疫细胞，更优选的为NK细胞。上述细胞是将上述慢病毒表达载体和包装质粒分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染包装细胞，更换完全培养基，收集上清液，浓缩病毒后感染细胞，即得。其中，所述包装质粒为慢病毒穿梭质粒和慢病毒辅助质粒；所述包装细胞为293T细胞。本专利技术通过对BALB/c小鼠进行免疫、细胞融合、高通量筛选，获得了分泌抗人GPC3抗体的杂交瘤细胞，提取总RNA，反转录形成cDNA，利用VH和VL引物扩增VH片段和VL片段。将pGEM-T载体与PCR产物(VH或VL)连接、转化、筛选、鉴定、测序，获得抗人GPC3单克隆抗体可变区基因序列。将获得的抗人GPC3单克隆抗体可变区基因序列、NK细胞表面抗原CD16A的抗体基因序列、NK信号肽序列、真核表达必须序列通过linker连接起来，装入慢病毒过表达质粒载体。制备慢病毒穿梭质粒、其辅助质粒和表达载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6h更换为完全培养基，浓缩病毒后得到NK细胞制品。本专利技术还提供了所述CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体或携带所述慢病毒载体的细胞在治疗制备肝癌试剂或药物中的应用本专利技术对高效表达的自分泌抗CD16A/GPC3抗体的NK细胞(BsAb-NK细胞)进行体内和体外有效性的验证。体外有效性分析结果表明：相同效靶比时，未修饰的NK细胞的杀瘤活性低于BsAb-NK细胞，在E:T＝5:1时BsAb-NK细胞杀瘤活性最大。高表达GPC3的肝癌细胞系和低表达GPC3的肝癌细胞系，BsAb-NK细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-2均高于未修饰的NK细胞。体内有效性分析结果表明：在GPC3小鼠模型中，随着NK及BsAb-NK细胞的注射治疗，小鼠的肿瘤体积相对对照组增长缓慢、体重下降缓慢，且BsAb-NK细胞组>NK细胞组>对照组。BsAb-NK细胞组、NK细胞组、对照组中位生存期分别为：前两者大于60天，BsAb-NK细胞组中位生存期大于NK细胞组；对照组为40天。本专利技术技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：本专利技术携带有CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体的细胞能有效消除肝癌细胞、抑制肝癌肿瘤体积增加的能力、延长肝癌患者的生存期，对于HCC治疗具有重要的意义。附图说明图1Anti-CD16A\本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体，其特征在于：由IgG的前导基因，抗CD16A VL基因，第一链接linker，抗GPC3 VH基因，第二链接linker，抗GPC3 VL基因，第三链接linker，抗CD16A VH基因，铰链序列基因，hIgG1 CH2基因以及hIgG1 CH3基因依次连接在一起后装入到慢病毒过表达质粒载体的位点，即得；其中，所述IgG的前导基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示；所述抗CD16A VL基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示；所述第一链接linker所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示；所述抗GPC3 VH基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.4所示；所述第二链接linker所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.5所示；所述抗GPC3 VL基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.6所示；所述第三链接linker所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.7所示；所述抗CD16A VH基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.8所示；所述铰链序列基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.9所示；所述hIgG1 CH2基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.10所示；所述hIgG1 CH3基因所编码的氨基酸序列为SEQ ID No.11所示。...

【技术特征摘要】
1.一种CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体，其特征在于：由IgG的前导基因，抗CD16AVL基因，第一链接linker，抗GPC3VH基因，第二链接linker，抗GPC3VL基因，第三链接linker，抗CD16AVH基因，铰链序列基因，hIgG1CH2基因以及hIgG1CH3基因依次连接在一起后装入到慢病毒过表达质粒载体的位点，即得；其中，所述IgG的前导基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.1所示；所述抗CD16AVL基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.2所示；所述第一链接linker所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.3所示；所述抗GPC3VH基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.4所示；所述第二链接linker所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.5所示；所述抗GPC3VL基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.6所示；所述第三链接linker所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.7所示；所述抗CD16AVH基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.8所示；所述铰链序列基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.9所示；所述hIgG1CH2基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.10所示；所述hIgG1CH3基因所编码的氨基酸序列为SEQIDNo.11所示。2.一种慢病毒基因表达系统，其特征在于，包含：慢病毒过表达质粒载体、慢病毒穿梭质粒和慢病毒辅助质粒，其中所述慢病毒过表达质粒载体为权利要求1所述的CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体。3.携带权利要求1所述的CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体的细胞。4.按照权利要求3所述的细胞，其特征在于：所述的细胞为免疫细胞，优选为NK细胞。5.构建权利要求1所述的CD16A/GPC3双抗慢病毒表达载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：将IgG的前导基因，抗CD16AVL基因，第一链接linker，抗GPC3VH基...

【专利技术属性】
技术研发人员：李陶，曹领改，刘佳，李玉花，周建华，邢小平，
申请(专利权)人：哈尔滨百伊生生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23