用于检测样品中重金属钴离子含量的酶联免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种检测重金属离子钴离子含量的酶联免疫试剂盒，包被有包被原的酶标板，酶标记物，钴离子螯合物特异性抗体，钴离子螯合物标准品溶液，底物显色液，终止液，浓缩洗涤液，浓缩复溶液。本发明专利技术还提供一种应用上述酶联免疫试剂盒检测钴离子螯合物的方法，它包括步骤：首先进行样品前处理，然后用试剂盒进行检测，最后分析检测结果。本发明专利技术提供的是检测食品、饲料、饮料、土壤、动物组织等样品中钴离子残留量的酶联免疫试剂盒及检测方法操作简便、费用低廉、灵敏度高、能够现场监控且适合大量样本筛查。

ELISA kit for detecting heavy metal cobalt ion content in sample

The invention provides a method for the detection of heavy metal ions cobalt ion content of the ELISA kit, covered by the original coated ELISA plate, an enzyme marker, cobalt chelate antibody, cobalt ion chelate standard solution, the substrate color solution, the termination solution, the condensed washing liquid, concentrated complex solution. The present invention also provides a method to detect a cobalt ion chelate using the ELISA kit, which comprises the following steps: firstly, sample pretreatment, and then using the kit for testing, the final analysis of the test results. The present invention is the detection of food, feed, beverage, soil, animal tissue samples cobalt residue ELISA kit and the detection method is simple, low cost, high sensitivity, suitable for a large number of samples to on-site monitoring and screening.

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及一种用于检测重金属离子钴离子的单克隆抗体及酶联免疫试剂盒。
技术介绍
：土壤和农产品中的重金属与人类健康密切相关。重金属污染主要指生物毒性显著地汞、铬、镉、铅以及类金属钴，还包括具有毒性的重金属铜、镍、锡等污染物。随着城市的扩大和大规模工业的发展，大最重金属进入环境后，即使浓度很低，也可能造成危害，通过饮用水，或者通过生物富集以及食物链等方式最终威胁入体健康。承金属污染不同于其他类型污染，具有隐蔽性、长期性和不可逆转性等特点。土壤中含钴量为0.05~65ppm,中值为8ppm。岩石风化为土壤，钴的浓度变化不大，如含钴为59ppm的玄武岩风化后含钴为81ppm，略有富集。实验表明:钴在土壤溶液中浓度为0.1~0.27毫克/升、1毫克/升、5.9毫克/升时,分别对西红柿、亚麻、甜菜有毒害作用。钴浓度为10毫克/升时，可使农作物死亡。环境标准美国规定灌溉用水钴的最大容许浓度为0.2毫克/升。所以，痕量重金属的定量分折在食品和环境检测等方而都是非常重要的。传统的重金属离子检测法如无火焰原子吸收光谱法、火焰原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱浊、伏安法和离了色谱浊，以及电热原了化原了吸收光谱法等，榆测必须在只各大型分析仪器的重点实验室内进行，无法用于现场检测，且受到费用高、处理量有限和检测时间长等限制，郁小利于在生产中推广应用，难以适心环境及市场产品的现场抽查及产品进口快速通关的要求；免疫学检测方法只有快速、廉价、灵敏和特异性强的优点，可同时完成高通量样品的检测，建立免疫分析法检测钴离子是生产及经济发展的需要。
技术实现思路
：本专利技术的目的：针对现有检测技术的不足和缺陷，制备出抗钴离子螯合物的高亲和力、特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，以此为基础提供一种用于检测钴离子含量的酶联免疫试剂盒，能够快速、简便、敏感、特异的检测食品、茶叶、饲料、饮料、土壤、水、动物组织等样品中的钴离子的含量。所述的检测钴离子的酶联免疫试剂盒，包括96孔或48孔酶标板、最佳工作浓度的Co2+mAb或pAb、最佳工作浓度的RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP、底物显色剂A、底物显色剂B、Co2+-DTPA-OVA或Co2+-DTPA-BSA包被并封闭好的酶标板、终止液，Co2+螯合物配置的标准品稀释液l～9，洗液(PBST)。所述的检测钴离子的酶联免疫试剂盒，用眼观或酶标仪获取结果，并根据结果绘制标准曲线，添加回归方程式，根据回归方程式分析计算所检测样品中的钴离子含量，对钴离子进行痕量分析。所述的检测钴离子的酶联免疫试剂盒，所用的钴离子标准品为钴离子与EDTA的螯合物，螯合物中钴离子含量采用石墨炉原子吸收光谱法检测获得螯合物半抗原中Sn的含量。所述单克隆抗体或多克隆抗体的制备方法为：A1、双功能螫合剂的选择:对氨基苯基-二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-DTPA)，双功能螯合剂1-(4-异硫氰根苯基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)，2-(4-异硫氰根苯基-l，4，7，10-四氮环十二烷四盐酸盐(P-SCN-Bn-DOTA)，然后在碱性或酸性环境下，将离子钴离子螯合在双功能螯合剂上；A2、Co2+-DTPA-载体蛋白人工抗原的合成：分别称取鸡卵清白蛋白(OVA)，牛血清白蛋白(BSA)和血蓝蛋白(KLH)20mg溶于lmL浓度为10mmoL/L，pH9.0的N-2-羟乙基哌嗪-N-乙磺酸缓冲液(HBS)中形成KLH、BSA、OVA溶液。称取10mg金属鳌合剂对氨基苯基-二乙三胺五乙酸(P-NH2-Bn-DTPA)溶于lmL二甲基亚飒(DMSO)中形成金属鳌合剂溶液；分别取l00uL金属鳌合剂溶液轻轻搅拌下逐滴滴加到0.5mLKLH和BSA溶液中，用10mol/LKOH调节pH至9.0，室温下反应24h。制备出钴离子人工抗原Co2+-DTPA-OVA，Co2+-DTPA-BSA，Co2+-DTPA-KLH，-20℃保存备用。A3、钴离子单克隆抗体和多克隆抗体的获得：用Co2+-DTPA-BSA，Co2+-DTPA-KLH免疫6周雌性BALB/C小鼠5只，剂量为25ug/0.2mL/只，背部皮下分点注射。采用细胞融合技术制备抗钴离子螯合物的单克隆抗体。无菌条件下取免疫鼠脾脏细胞，在聚乙二醇PEG-1500作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合；用间接ELISA法测定细胞上清抗体效价，用阻断ELISA法测定上清抗体抑制率，进行阳性孔筛选，用经GF-AAS检测获得Co2+-鳌合剂做钴离子标准液，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行亚克隆和扩大培养、通过鉴定，获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备Co2+mAb；多抗制备：用Co2+-DTPA-BSA，Co2+-DTPA-KLH人工抗原免疫新西兰大白兔，免疫剂量为50ug～100ug/次，背部皮下分多点注射或足底注射；首免用弗氏完全佐剂乳化；加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫5次，每次间隔8周，最后一次免疫后10～15天，以ELISA法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清。以饱和硫酸铵盐析法提取IgG抗体，-20℃冻存备用。本专利技术的检测钴离子酶联免疫试剂盒具有下列各项优点：①特异性强，敏感性高。该检测钴离子酶联免疫试剂盒以高亲和力的单克隆抗体(mAb)或多克隆抗体(pAb)为基础制备而成。酶联免疫试剂盒采用的是非均相间接竞争模式，其基本原理是样品中的Co2+与过量鳌合剂鳌合成可溶性的Co2+-鳌合剂复合物后，将其与已包被于酶标板上的包被抗原Co2+-鳌合剂-载体蛋白复合物共同竞争Co2+mAb上有限的结合位点，反应达到平衡后洗脱多余的Co2+-鳌合剂和Co2+mAb，然后与酶标二抗反应，用酶及其底物显色系统显示抗原抗体的结合情况，进而定量检测Co2+在样品中的含量。该试剂盒最低检测限为0.248ug/L，检测范围为3.774～442.39ug/L，与其它金属离子交叉反应较小。②简便、快速、时效性强。使用该检测钴离子酶联免疫试剂盒，无需其它试剂和仪器，可现场操作，只要按照该试剂盒说明书上操作步骤进行检测，60分钟内即可判定检测结果，并根据结果可计算样品中钴离子含量。③结果显示直观、形象、准确。酶联免疫试剂盒固相上的酶量与标本中受检物质的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。显色液和底物不同显示不同颜色，本试剂盒底物为过氧化脲，显色剂为四甲基联苯胺(TMB)，终止液为2mol/L的硫酸溶液，故显示蓝色，终止后显色为黄色，肉眼可见。与所提供的标准检测液比较，显色越深则待测物中钴离子含量越低或不含，显色越淡或不显色者说明样品中含有待检物，且含量越高，如有酶标仪可进行度数，度数后根据稀释比例进行计算可得出钴离子的含量。④适用范围广，节省费用，便于推广。使用酶联免疫试剂盒，比用仪器分析的费用大幅下降。另外，酶联免疫试剂盒的适用范围广，可满足不同层次人员需要，包括专业检验，海关检疫，卫生检疫，质量监测，加工企业和养殖场户等，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济、社会效益。附图说明：图1为检测钴离子酶联免疫试剂盒的标准曲线图具体实施方式：一种用于检测钴离子酶联免疫试剂盒，它包括检测酶标板、用于检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测食品、饮料、茶叶、土壤、动物组织等样品中的钴离子残留与含量的酶联免疫试剂盒。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测食品、饮料、茶叶、土壤、动物组织等样品中的钴离子残留与含量的酶联免疫试剂盒。2.根据权利要求1所述钴离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：包括包被Co2+-DOTA-BSA或Co2+-DOTA-OVA并封闭好的96孔或48孔酶标板，以Co2+-DOTA-BSA或Co2+-DOTA-OVA为抗原制备的钴离子多克隆或单克隆抗体Co2+mAb或pAb，酶标二抗为兔抗鼠或羊抗鼠抗体标记辣根过氧化物酶RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP，Co2+螯合物配置的标准品稀释液，洗液为0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液含0.05％Tween-20(PBST)，底物显色剂A为过氧化脲，底物显色剂B为四甲基联苯胺(TMB)，终止液为2mol/L的硫酸溶液。3.根据权利要求l、2所述的钴离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的酶联免疫试剂盒由以下步骤制备：(1)包被：酶标板上用Co2+-DTPA-BSA包被；(2)封闭；采用浓度为0.05％的猪血清进行封闭；(3)单克隆抗体的制备：用Co2+-DOTA-KLH和Co2+-DOTA-BSA分别免疫6周龄雌性BALB/C小鼠；采用细胞融合技术无菌取脾脏制备脾细胞，在聚乙二醇-1500作用下与NS0骨髓瘤细胞进行融合：用间接ELISA法和阻断ELISA法进行阳性孔筛选，选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行有限稀释克隆化，扩大培养、冻存并鉴定，获得一株杂交瘤细胞株；之后采用体内诱生腹水法制备抗钴离子螯合物的mAb；(4)EDTA反应液的配制：称取10mgEDTA溶于l0mMHBS缓冲液配制成浓度为34.2mmoL/LEDTA溶液；(5)Co2+标准溶液的配制：称取100mg氯化钴溶于100uL浓硝酸，待充分溶解加超纯水使终体积为1mL，形成钴溶液，与EDTA溶液混匀后，用NaOH调节pH值，室温反应24小时，即形成Co2+-EDTA鳌合物溶液；(6)二抗的配制：酶标二抗RaMIgG-HRP或GaMIgG-HRP按照l：1000的工作浓度用洗液稀释分装；(7)底物、显色液与洗液的配制：底物、显色液与洗液分装配制；(8)终止液为2mol/L的硫酸溶液。4.根据权利要求3所述钴离子酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的检测抗原Co2+-DOTA-Proten，其制备步骤：(1)称取100mg氯化钴溶于浓硝酸，溶解后加超纯水使终体积为lmL，形成钴溶液；(2)称取10mgEDTA溶于10mMHBS缓冲液配制成EDTA溶液；(3)将(1)，(2)混匀后，用NaOH调节pH值，反应24小时，形成Co2+-E...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜霞，洪霞，刘静，
申请(专利权)人：镇江亿特生物科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32