本发明专利技术公开了一种提高低温β‑半乳糖苷酶产量的方法，属于发酵工程技术领域。本提供了一种提高低温β‑半乳糖苷酶产量的发酵培养基及发酵方法，是将产低温β‑半乳糖苷酶的重组大肠杆菌在该发酵培养基中发酵，结果显示，采用本发明专利技术的方法进行发酵后，低温β‑半乳糖苷酶的酶活由最初的8.53U/mL提高到37.67U/mL，为β‑半乳糖苷酶的工业化生产的应用奠定了很好的基础。
A method for improving the low temperature beta galactosidase production
The invention discloses a method for improving the low temperature beta galactosidase production, which belongs to the technical field of fermentation engineering. This provides a method to improve the fermentation medium and fermentation temperature beta galactosidase production by recombinant Escherichia coli, is producing low temperature beta galactosidase showed in the fermentation medium, the fermentation, the method of the invention after the fermentation, was increased from 8.53U/mL to 37.67U/mL live low beta galactosidase enzyme, which lay a good foundation for the application of beta galactosidase production.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种提高低温β-半乳糖苷酶产量的方法，属于发酵工程
技术介绍
β-半乳糖苷酶，俗称乳糖酶，可来源于动物、植物和微生物。β-半乳糖苷酶同时具有水解和转糖苷合成两种功能。目前，乳糖酶的应用领域很广。在乳品工业中，乳糖酶可用于生产低乳糖制品和低聚半乳糖。在乳品加工中，采用乳糖酶水解乳糖，可以避免冷冻浓缩乳制品中乳糖的结晶、乳清析出等问题。在酸奶的生产中，可加速酸化反应和提高发酵效率，使酸奶具有特有的乳香风味。在干酪生产中，可以加速干酪的成熟。在分析方面，将葡萄糖氧化酶和乳糖酶联合使用制备生物传感器，直接测定牛乳等乳制品中乳糖的含量。在环境保护方面，乳糖酶可以分解乳清中的乳糖，减缓乳清排放后较高的生物需氧量对水造成的污染。其他方面，乳糖酶与桃果实成熟前期果实的软化启动密切相关，能促进其成熟及软化。低温β-半乳糖苷酶具有在低温下的高活性的优点，应用在乳品加工和治理由乳清引起的环境污染，有着中温和高温乳糖酶无法达到的优越性。但目前β-半乳糖苷酶在发酵生产中存在产量低的问题，如何提高产量成为迫切需要解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种提高低温β-半乳糖苷酶酶活的方法，所述方法是将产低温β-半乳糖苷酶的菌株接种含蔗糖15～25g/L、蛋白胨7.5～10g/L、酵母粉7.5～10g/L、氯化钙0.25～0.75g/L的发酵培养基中，30℃，200～250rpm发酵12～60h。在本专利技术的一种实施方式中，所述菌株是以pET32a(+)为载体，以E.coliBL21(DE3)pLysS为宿主，表达SEQIDNO.1所示β-半乳糖苷酶基因的重组大肠杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述接种是按体积比接种2～5％的种子液。在本专利技术的一种实施方式中，所述种子液是挑取活化后的重组大肠杆菌单菌落，接种至LB液体培养基中，37℃培养至OD600＝1.4～2.0。在本专利技术的一种实施方式中，所述活化是将保藏的重组大肠杆菌涂布于LB固体培养基上，37℃培养12h以上。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体包括：(1)以大肠杆菌BL21(DE3)为出发菌株，以pET32a(+)为载体，表达SEQIDNO.1所示β-半乳糖苷酶基因，获得重组大肠杆菌；(2)将重组大肠杆菌在含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上活化12h，挑取单菌落接入LB液体培养基，37℃培养8h，转接至所述发酵培养基进行发酵。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵控制发酵温度为30℃，pH6.5，通气量为1vvm，最低溶氧维持在20％，搅拌转速与溶氧偶联，转速为200-900rpm，发酵16h。发酵2h时加入乳糖诱导，使发酵液乳糖浓度达到0.1g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵过程控制温度为30℃，pH为6.5，溶氧为20％，通气量为1vvm，搅拌转速与溶氧偶联，转速为200-900rpm，发酵2h时加入乳糖诱导，使发酵液乳糖浓度达到0.1g/L，6h时一次性补加浓度分别为150g/L的乳糖和蔗糖100mL，发酵总时间16～24h。的第二个目的是提供一种提高低温β-半乳糖苷酶产量的发酵培养基，其成分包括蔗糖15～25g/L、蛋白胨7.5～10g/L、酵母粉7.5～10g/L、氯化钙0.25～0.75g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基含有：蔗糖25g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、氯化钙0.5g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基含有：蔗糖15g/L、蛋白胨7.5g/L、酵母粉7.5g/L、氯化钙0.5g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基含有：蔗糖15g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、氯化钙0.75g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基含有：蔗糖20g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉7.5g/L、氯化钙0.5g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基含有：蔗糖25g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉7.5g/L、氯化钙0.25g/L。本专利技术的第三个目的是提供所述发酵培养基在食品、医药、化工领域中发酵生产方面的应用。本专利技术还提供所述方法在生产含低温β-半乳糖苷酶的产品中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的发酵培养基及发酵方法可以使重组大肠杆菌产低温β-半乳糖苷酶的酶活由8.53U/mL提高到37.67U/mL，酶活提高了3倍，且酶的耐低温特性不发生改变。具体实施方式LB培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/Lβ-半乳糖苷酶酶活力测定方法：采用分光光度计法，配制600μmol/mL的ONPG(邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷)反应液(ONPG用pH7.2的50mMNa2HPO4-NaH2PO4磷酸钠缓冲液溶解)，吸取2.4mL反应液加入0.1mL稀释的酶液(空白先加反应液和Na2CO3，再加细胞破碎液)。25℃反应15min，加入等体积的1mol/L的Na2CO3终止反应，在415nm处测吸光度值，对照ONP标准曲线得出酶转化人工底物ONPG的量，再计算酶活性。实施例1(1)用EcoRI/XhoI双酶切载体pET32a(+)及SEQIDNO.1所示基因，将酶切产物用T4连接酶16℃连接16h，连接产物转感受态E.coliDH5α细胞。挑阳性克隆进行EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切和测序鉴定，将鉴定正确的质粒转化至E.coliBL21(DE3)pLysS。(2)将步骤1构建的重组大肠杆菌涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养12h以上；挑取单菌落接到50mLLB液体培养基中(250mL摇瓶，含50μg/mL卡那霉素)，37℃，200rpm培养8-9h，直至OD600达到1.4-2.0，转接至LB培养基中，结果显示，发酵10h后，酶活达8.53U/mL。实施例2(1)种子活化：将实施例1构建的重组大肠杆菌涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养12h以上。(2)种子液制备：挑取单菌落接到50mLLB液体培养基中(250mL摇瓶，含50μg/mL卡那霉素)，37℃，200rpm培养8-9h，直至OD600达到1.4-2.0。(3)配制发酵培养基：蔗糖25g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、氯化钙0.5g/L。(4)低温β-半乳糖苷酶的发酵：将种子液以2％(按体积比)的接种量转接至发酵培养基中，30℃培养10h，在发酵2h时加入乳糖诱导，使发酵液乳糖浓度达到0.1g/L。(4)发酵液离心后菌体加Tris-HCl细胞破碎液(pH8.0)洗涤两次后再次悬浮菌体超声破碎，离心后取上清液，测定酶活。结果显示，发酵10h后，酶活达21.91U/mL。实施例3实施方式同实施例2，区别在于，发酵培养基成分为：蔗糖15g/L、蛋白胨7.5g/L、酵母粉7.5g/L、氯化钙0.5g/L。经测定，发酵10h后，酶活达15.85.U/mL。实施例4实施方式同实施例2，区别在于，发酵培养基成分为：蔗糖15g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉10g/L、氯化钙0.75g/L。经测定，发酵10h后，酶活达16.34.U/mL。实施例5实施方本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高低温β‑半乳糖苷酶酶活的方法，其特征在于，所述方法是将产低温β‑半乳糖苷酶的菌株接种至发酵培养基中，30℃，200～250rpm发酵12～60h；所述发酵培养基含有蔗糖15～25g/L、蛋白胨7.5～10g/L、酵母粉7.5～10g/L、氯化钙0.25～0.75g/L。
【技术特征摘要】
1.一种提高低温β-半乳糖苷酶酶活的方法，其特征在于，所述方法是将产低温β-半乳糖苷酶的菌株接种至发酵培养基中，30℃，200～250rpm发酵12～60h；所述发酵培养基含有蔗糖15～25g/L、蛋白胨7.5～10g/L、酵母粉7.5～10g/L、氯化钙0.25～0.75g/L。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌株是以pET32a(+)为载体，以E.coliBL21(DE3)pLysS为宿主，表达SEQIDNO.1所示β-半乳糖苷酶基因的重组大肠杆菌。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种是按体积比接种2～5％的种子液；所述种子液是挑取活化后的重组大肠杆菌的单菌落，接种至LB液体培养基中，37℃培养至OD600＝1.4～2.0。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述活化是将重组大肠杆菌涂布于LB固体培养基上，37℃培养12h以上。5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁重阳，缪明永，朱五二，王琼，韩青权，陈炀，胡凡，冷爽，扈芳，艾连中，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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