一株酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用制造技术

一种酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。该精氨酸脱亚胺酶突变体为酶活性中心附近的甘氨酸突变为脯氨酸，即Gly292 Pro。本发明专利技术利用定点突变技术对野生型精氨酸脱亚胺酶arcA编码基因进行分子改造，得到了一种突变体酶ADIG292P，相对于野生型精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列的第292位甘氨酸突变为脯氨酸。本发明专利技术所述的定点突变改造的精氨酸脱亚胺酶与野生酶相比其酶活力提高了1.5倍，在40℃下的半衰期提高了5.43倍，解决了精氨酸脱亚胺酶催化瓜氨酸合成时，催化能力和温度稳定性低的问题，为高效合成瓜氨酸的工业化生产及医药应用奠定了基础。

Arginine lysine mutant with enhanced enzyme activity and temperature stability and application thereof

The present invention relates to a kind of arginine enzyme mutant with improved enzyme activity and temperature stability, and belongs to the field of gene engineering and enzyme engineering. The arginine deiminase mutant is near the active center of the enzyme mutation of glycine to proline, namely Gly292 Pro. The invention uses technology of wild-type arginine deiminase gene encoding arcA molecular modification site directed mutagenesis, obtained a mutant enzyme ADIG292P, compared with wild type metarginase amino acid sequences of 292nd glycine proline mutation. Arginine designated the mutated deiminase activity compared with the wild-type enzyme increased 1.5 times at 40 DEG C, the half-life was 5.43 times higher than that of solving the arginine deiminase catalyzes citrulline synthesis, catalytic ability and low temperature stability problems, laid the foundation of industrialization production and pharmaceutical applications for efficient synthesis of citrulline.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程

技术介绍
精氨酸脱亚胺酶（Argininedeiminase，EC3.5.3.6）简称ADI，它能将精氨酸水解，生成瓜氨酸和氨。自从1933年首次报道以来，已在乳链球菌、粪链球菌、酵母、假单胞菌、支原体、盐杆菌及部分真核细胞等中发现有该酶存在。精氨酸脱亚胺酶来源广泛，目前在细菌、古细菌及一些真核细胞中均有发现。不同微生物来源的ADI分子量范围、最适pH、最适温度等性质均有明显的差异。但这些ADI均有分解精氨酸的能力。瓜氨酸(Citrulline)又名氨基甲酰鸟氨酸(Carbamylornithineornithin)，由于最初是从西瓜中提取，因而得名。近年来，研究发现瓜氨酸具有清除自由基、影响人体内氮平衡、心血管系统的免疫调节等生理功能。因此，瓜氨酸在食品医药等方面的应用日益增加。由于瓜氨酸的抗衰老、增强免疫力、提高运动员肌肉力量和耐力等功能，已有加拿大公司生产的运动功能性饮料中添加瓜氨酸。同时，在欧美国家也有含有瓜氨酸的保健护肤品上市销售。生产瓜氨酸主要有化学法、提取法、发酵法和酶法四种生产方式。其中，化学法是目前主要的生产方式，但其生产过程中产生的铜离子和硫化氢等副产物产生对环境造成不利影响。提取法和发酵法生产瓜氨酸均有产率低和成本高的问题，不利于大规模生产。而使用酶法生产瓜氨酸具有反应条件温和、转化效率高、提取工艺简单等优点，具有较高的研究和生产价值。因此，寻找催化效率更高、安全稳定的精氨酸脱亚胺酶成为酶法生产瓜氨酸的关键问题。定点突变（sit-directedmutagenesis）是一种分子改造的主要手段，是指在目的DNA片段的指定位点引入特定的碱基对，从而改变其编码的氨基酸序列的技术。与其他改善分子改造的策略相比，定点突变更为迅速、直接和节约成本，因此它是实验室常用的基因改造的手段之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，通过对精氨酸脱亚胺酶的分子改造，使改造后的精氨酸脱亚胺酶的酶活和温度稳定性有所提高，最终应用于瓜氨酸的生产及医药。本专利技术提供了一种定点突变改造的精氨酸脱亚胺酶突变体，由粪肠球菌EnterococcusfaecalisSK32.001的精氨酸脱亚胺酶基因出发，运用定点突变技术获得，所述的精氨酸脱亚胺酶突变体的氨基酸序列为SEQIDNo.1，该精氨酸脱亚胺酶突变体是由SEQIDNo.2的核苷酸系列所编码。所述的氨基酸发生突变位于精氨酸脱亚胺酶蛋白结构的外部，所述的突变可能可以增加蛋白疏水相互作用或静电相互作用。本专利技术的技术方案：一种酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNo.1。所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体的基因DNA，其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。一种重组质粒，包含了所述的DNA分子。一种宿主细胞，其含有如所述的DNA分子，或含有如所述的重组质粒。所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，将含有精氨酸脱亚胺酶突变体基因序列DNA的重组质粒转入大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)宿主中，构建突变体，进行序列验证确认，得到一株酶活和温度稳定性提高的突变体Gly292Pro。第292位甘氨酸Gly突变为脯氨酸Pro。所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体的构建方法，包括如下步骤：1、根据EnterococcusfaecalisSK32.001的精氨酸脱亚胺酶arcA基因序列设计引物，以含有精氨酸脱亚胺酶序列的EnterococcusfaecalisSK32.001为模板，通过PCR的方法获得含有精氨酸脱亚胺酶arcA的基因片段，与表达载体pET-28a连接构建重组质粒；2、利用B-FITTER软件识别出酶分子中对温度稳定性有不利影响的关键氨基酸残基，然后利用SWISS-MODEL软件对亲本精氨酸脱亚胺酶进行蛋白结构模拟，获得精氨酸脱亚胺酶三级结构；通过分析对比，确定要突变的氨基酸位点为第292位甘氨酸；3、设计突变引物，使用一步PCR法对精氨酸脱亚胺酶的核苷酸序列进行定点突变，将所述第292位的氨基酸进行替换，获得含精氨酸脱亚胺酶突变体基因序列的重组载体；4、将含有精氨酸脱亚胺酶突变体基因序列的重组载体通过热激转化进入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，并诱导表达，收集菌体，超声破碎细胞后使用Ni-NTA进行蛋白分离纯化，获得精氨酸脱亚胺酶突变体。所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体的应用，所述的精氨酸脱亚胺酶突变体用于瓜氨酸的生产及医药。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的精氨酸脱亚胺酶突变体酶活和温度稳定性均有提高，其中酶活提高了1.5倍，在40℃下的半衰期提高了5.43倍。本专利技术优化改良了野生型的精氨酸脱亚胺酶酶活和温度稳定性较低的问题，为该酶用于瓜氨酸的生产及医药创造良好的条件。本专利技术所用的精氨酸脱亚胺酶的基因arcA来自于一株可生产瓜氨酸的粪肠球菌，该菌株编号CCTCCNO：M2011465，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，命名为SK32.001（EnterococcusfaecalisSK32.001），在中国专利CN102433290A中已经公布。附图说明图1：重组质粒pET-28a-ADIG292P的构建图谱。图2：野生酶和突变酶的在40℃的温度稳定性。图3：野生酶和突变酶的生物合成瓜氨酸转化率。具体实施方式以下通过实施例来进一步阐明本专利技术，下列实施例用于说明目的而非用于限制本专利技术范围。材料与试剂：所用的限制性内切酶、SolutionⅠ连接酶、PCR试剂等均购于TaKaRa宝生物公司；质粒提取试剂盒、基因组提取试剂盒、琼脂糖纯化试剂盒、大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）菌株、引物均购于生工生物工程（上海）有限公司；其他试剂均为国内或国外购买的分析纯试剂。实施例1：重组质粒的构建将EnterococcusfaecalisSK32.001培养至指数生长中期，取2mL菌液10000r/min离心10min弃上清，溶菌酶处理30min后按照试剂盒说明提取基因组DNA。设计如下的引物来用于arcA的扩增：FADI-2：5’-CGCGGATCCATGAGTCATCCAATTAATGT-3’(含BamHI酶切位点），RADI-2：5’-CCGCTCGAGTTAAAGATCTTCACGGT-3’（含XhoⅠ酶切位点），PCR扩增条件：95℃变性3min，30个循环（95℃30s，55℃30s，72℃210s），最后72℃延伸2min。扩增产物纯化后，用BamHI及XhoⅠ对PCR产物及载体pET-28a-c(+)进行双酶切，分别回收酶切产物，用SolutionⅠ连接酶16℃下连接2h，热激转化到DH5α细胞中，待平板长出转化子后，挑取单菌落到液体培养基中，提取质粒，通过酶切验证重组质粒pET-28a-ADI。将重组质粒转化到BL21(DE3)细胞中，得到BL21(DE3)/pET-28a-ADI工程菌。实施例2：精氨酸脱亚胺酶突变位点的确定使用软件B-FITTER计算出亲本精氨酸脱亚胺酶氨基酸残基的温度因子（B-factor），获得酶分子中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID No.1。

【技术特征摘要】
1.一种酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，其氨基酸序列为SEQIDNo.1。2.权利要求1所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体的基因DNA，其特征在于其核苷酸序列如SEQIDNo.2所示。3.一种重组质粒，其特征在于包含了权利要求2所述的DNA分子。4.一种宿主细胞，其特征在于其含有如权利要求2所述的DNA分子，或含有如权利要求3所述的重组质粒。5.根据权利要求1所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，将含有精氨酸脱亚胺酶突变体基因序列DNA的重组质粒转入大肠杆菌EscherichiacoliBL21(DE3)宿主中，构建突变体，进行序列验证确认，得到一株酶活和温度稳定性提高的突变体Gly292Pro。6.根据权利要求1所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体，其特征在于，第292位甘氨酸Gly突变为脯氨酸Pro。7.权利要求1所述的酶活和温度稳定性提高的精氨酸脱亚胺酶突变体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1）根据EnterococcusfaecalisSK32.001的精氨酸脱亚胺...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，江波，蒋航宇，沐万孟，缪铭，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32