本发明专利技术公开了一种用于表达米曲霉葡萄糖淀粉酶的启动子及其应用，属于基因工程领域。本发明专利技术通过串联glaA启动子的核心区域，构建了一个新型的葡萄糖淀粉酶启动子PN5。在原始的启动子和新的启动子的介导下在米曲霉内过表达glaA基因，并用于发酵淀粉生产L‑苹果酸。结果表明，PN5‑glaA基因的平均表达活性和重组菌的苹果酸产量明显高于PglaA‑glaA基因。该启动子改造及其应用的方法简单高效，为目的基因在米曲霉内的同源或异源表达提供了理论基础，同时对于米曲霉发酵淀粉生产目的产物具有实际生产意义。
Promoter for expressing glucoamylase of Aspergillus oryzae and application thereof
The invention discloses a promoter for the expression of glucoamylase of Aspergillus oryzae and an application thereof, belonging to the field of gene engineering. In the present invention, a novel glucoamylase promoter PN5 was constructed by linking the core region of glaA promoter. In the original promoter and new promoter mediated the expression of glaA gene in Aspergillus oryzae, and for the fermentation of starch production L malic acid. The results show that the yield of recombinant malic acid bacteria activity and the average expression of PN5 glaA gene was significantly higher than that of PglaA glaA gene. For the transformation of the promoter and its application is simple and effective, and provides the theoretical basis for the target gene in Aspergillus oryzae in homologous or heterologous expression, and has practical significance for the production of product of Aspergillus oryzae Fermented starch.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于表达米曲霉葡萄糖淀粉酶的启动子及其应用，属于基因工程领域。
技术介绍
米曲霉作为“generallyregardedassafe”(GRAS)安全菌株，早在1000多年前已被应用于食品、饲料、产酸、酿酒等发酵工业，是理想的真核表达载体。米曲霉能够产生丰富的淀粉酶系，包括葡萄糖淀粉酶、淀粉水解酶、葡萄糖苷酶等。同时，米曲霉能够天然的积累很多中间代谢物，如有机酸，氨基酸等。现有技术通过对野生型米曲霉NRRL3488进行一系列的代谢改造，获得了一株发酵葡萄糖高产L-苹果酸的重组菌A.oryzaema37(申请号为201610603538.0的专利技术专利申请中公开)。将该菌株在以淀粉为唯一碳源的培养基中培养，仍能积累较高浓度的苹果酸(55g/L)。由于淀粉溶液的粘度大，影响发酵过程中的传质和菌体生长，因此，将苹果酸生产工业化，仍需要克服菌体淀粉利用率低的技术问题。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种淀粉诱导型的强启动子，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第二个目的是提供所述重组启动子的构建方法，是将GenBank:AP007175.1位于1942232～1942328处的97个bp碱基串联五个拷贝。本专利技术的第三个目的是提供携带所述淀粉诱导型启动子的载体或细胞系。本专利技术的第四个目的是提供一种基因工程菌，是在启动子PN5或PglaA的介导下，表达编码葡萄糖淀粉酶的基因glaA；所述启动子PN5的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述编码葡萄糖淀粉酶的基因glaA是NCBIGeneID为5999830的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌是以质粒pMD19为载体，在启动子PN5或PglaA的介导下，表达所述基因glaA。在本专利技术的一种实施方式中，所述启动子PN5序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述葡萄糖淀粉酶启动子PglaA序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的第五个目的是提供所述基因工程菌的构建方法，是以质粒pMD19为载体，分别与SEQIDNO.1所示启动子和NCBIGeneID为5999830的基因glaA连接，转化至米曲霉细胞中。本专利技术的第六个目的是提供一种生产L-苹果酸的方法，是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，28～30℃，200～250rpm发酵48～120h。在本专利技术的一种实施方式中，所述接种是按体积以10％的接种量进行接种。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基含有(按g/L计)：可溶性淀粉100，胰蛋白胨12，K2HPO40.15，KH2PO40.15，MgSO4·7H200.1，CaCl2·H200.1，NaCl0.005，FeSO4·7H200.005，CaCO390。本专利技术还提供所述基因工程菌在生产有机酸方面的应用。有益效果：本专利技术提供的通过构建重组的强启动子提高葡萄糖淀粉酶基因的表达的方法简单有效，经该方法改造后的重组菌株A.oryzaePN5可高效利用淀粉生产L-苹果酸。经过96h摇瓶发酵，PN5可转化100g/L可溶性淀粉生成63g/L的L-苹果酸，与对照相比提高了14.5％。本专利技术的实验成果为米曲霉发酵生产L-苹果酸提供了新的可用的低廉高效的碳源，也为进一步代谢改造米曲霉生产苹果酸奠定了良好的基础。具体实施方式种子培养基(g/L)：葡萄糖30，胰蛋白胨3，KH2PO40.75，K2HPO40.75，NaH2PO40.56，K2HPO40.56,MgSO4·7H200.075，CaCl2·H200.075，0.75mL微营养液(5gNaCl、5gFeSO4·7H20、1g柠檬酸)。发酵培养基(g/L)：可溶性淀粉100，胰蛋白胨12，K2HPO40.15，KH2PO40.15，MgSO4·7H200.1，CaCl2·H200.1，NaCl0.005，FeSO4·7H200.005，CaCO390。培养条件：米曲霉固体培养为34℃恒温培养3-7天，米曲霉摇瓶种子培养基孢子终浓度为1.5×106个/mL，30℃、200rpm培养14h，以10％的接种量转接发酵培养基，30℃、200rpm发酵96h。苹果酸的测定方法：高效液相色谱(HPLC)检测法：Agilent1200，UV检测器，C18柱(250×4.6mm，5μm)，流动相：10％甲醇和0.75mmol稀磷酸。流速0.7mL/min，柱温20℃，波长210nm，进样体积为10μL。样品制备：向已知体积的发酵液中加入相同体积的2MHCl以溶解生成的苹果酸钙沉淀和残留的CaCO3。离心后再稀释5倍，经0.22μm滤膜过滤后，滤液用于液相检测。实施例1构建重组启动子PN5根据NCBI上公布的米曲霉葡萄糖淀粉酶启动子PglaA的上下游序列，设计引物：使用PglaA-1/PglaA-2引物扩增PglaA启动子序列，使用97-1～5等五对引物扩增要串联的97bp核心序列。首先将出发启动子PglaA的DNA片段连接pMD19-Tvector，构建出发质粒pMD19-gla-1，分别通过五组双酶切speI/pmeI，SalI/speI，HindIII/SalI，pmeI/xbaI，xbaI/kpnI，引入五个拷贝的启动子目的序列，得到重组质粒pMD19-gla-2。该质粒上引入的即为完整的重组启动子序列。实施例2glaA基因过表达载体的构建根据NCBI上公布的米曲霉基因组中glaA基因的上下游序列，设计引物：glaA-1AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGGTGTCTTTCTCCTCTTGTCTCCglaA-2GGGGTACCGGCGCGCCGTGTATTGCCGTCATCAGATAATGG以米曲霉基因组为模板，通过PCR克隆glaA基因，kpnI/NotI分别双酶切质粒pMD19-gla-1、pMD19-gla-2和目的基因，连接构建重组质粒pMD19-gla-3和pMD19-gla-4。使用HindIII/salI分别双酶切质粒pMD19-gla-3、pMD19-gla-4和带有ble抗性基因的质粒pbg(以pMD19为载体，连有Ppgk、ble基因和Tgla),连接得到重组质粒pMD-P1和pMD-PN5。实施例3米曲霉原生质体转化和转化子的筛选质粒构建完成后，使用快切酶AscI/HindIII双酶切得到目的片段，通过1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化目的DNA，用于转化米曲霉原生质体。所述目的基因导入米曲霉基因组的方法为原生质体转化法，插入方式为随机整合。原生质体制备方法参见文献2013年公开的论文《MetabolicengineeringofAspergillusoryzaeNRRL3488forincreasedproductionofL-malicacid》；原生质体转化方法参见2013年公开的论文《SixnovelconstitutivepromotersformetabolicengineeringofAspergillusniger》。将重组质粒转化至米曲霉原生质体中，将筛选到的阳性转化子通过选择性平板数次传代得到纯合的米曲霉重组菌株，含有重组质粒pMD-P1的重组菌命名为A.oryz本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种淀粉诱导型强启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种淀粉诱导型强启动子，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.构建权利要求1所述启动子的方法，其特征在于，是将GenBank登录号为AP007175.1的核苷酸序列位于1942232～1942328处的97个bp碱基串联五个拷贝。3.携带权利要求1所述的淀粉诱导型强启动子的载体或细胞系。4.一种基因工程菌，其特征在于，在启动子PN5/或PglaA的介导下，表达编码葡萄糖淀粉酶的基因glaA；所述启动子PN5的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。5.根据权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码葡萄糖淀粉酶的基因glaA是NCBIGeneID为5999830的基因。6.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘龙，陈坚，刘晶晶，堵国成，李江华，房峻，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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