一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法，将标签蛋白基因与目标蛋白基因构建到表达载体上，导入到大肠杆菌中构建得到重组菌，重组菌诱导表达，标签蛋白与目标蛋白进行融合表达，从而提高糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达；所述标签蛋白基因为3’‑磷酸腺苷‑5’磷酸酶基因、2‑氧代‑3‑脱氧‑6磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因或者抗终止作用因子基因中的至少一种，将标签蛋白基因构建在表达载体的Nde I和Hind III之间，将目标蛋白构建在Hind III和EcoR I之间，且标签蛋白和目标蛋白的之间添加一组肠激酶酶切位点，蛋白序列为DDDDK。融合表达与之前目标蛋白单独表达相比，蛋白的可溶性增加一倍，且酶活提高了80%。

Method for increasing soluble heterologous expression of plant source glycosyl transferase gene

The invention discloses a method for increasing plant sources of glycosyltransferase enzyme gene expression of soluble heterologous, label protein gene and target gene to construct the expression vector into E.coli, recombinant bacteria, recombinant expression, tag protein and target protein fusion expression, so as to improve the expression of soluble sugar a group of enzymes in Escherichia coli; the tag protein gene 3 '5' monophosphate phosphatase gene, 2 oxo 3 deoxy glucose 6 phosphate acid aldolase gene or termination of at least one factor gene, label protein gene expression vector Nde constructed in between I and Hind III, the target protein was constructed in Hind III and EcoR between I, and the tag protein and the target protein adds a group of enterokinase cleavage site, protein sequence As DDDDK. Compared with the expression of the target protein, the fusion protein expression was doubled and the enzyme activity was increased by 80%.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法。
技术介绍
甜菊糖是一种从甜味菊茎叶中提取的天然甜味剂，其主要成分为甜菊糖甙，它是一种高甜度、低热值的非发酵性的天然甜味剂。甜度约为蔗糖的200～300倍，其中提纯的莱鲍迪甙A糖的甜度约为蔗糖的450倍，味感更佳。甜菊糖的热值仅为蔗糖的1/300，与蔗糖、葡萄糖等天然甜味剂，甜密素、阿斯巴甜等化学合成甜味剂相比，甜菊糖具有热量低、甜度高、味质好、耐高温、稳定性好等特点，摄入人体后不被吸收，不产生热量，是糖尿病和肥胖病患者适用的甜味剂。甜菊糖是继甘蔗甜菜糖之外第三种有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被国际誉为“世界第三蔗糖”。甜菊叶中三种最主要的糖苷成分在叶片中的含量通常为：甜菊苷（Stevioside，St甙）占叶片干重9.1%，莱鲍迪苷A（RebaudiosideA,RA甙)占3.8%，莱鲍迪苷C占0.6%。其中RA甙与其它糖苷相比，其甜度高，且甜味纯正，口感也更接近蔗糖，甘苦味和甘草异味低，稳定性好，是一种理想的天然高倍甜味剂产品。因此，提高甜菊糖甙的含量，尤其是提高RA甙的纯度，获得高品质的甜菊糖，成为甜菊糖产业升级和产品改进的重要目标和内容。目前已发现的糖基转移酶UGT76G1可通过一步糖基化反应将St甙转化生成RA甙[1]。但是植物来源的糖基转移酶UGT76G1在大肠杆菌中表达会产生大量包涵体，实际可溶性表达很低。针对外源基因在异源表达时出现包涵体现象，目前研究人员提出了较多的解决方法，如：优化密码子[2]、降低诱导温度[3]、降低诱导物的浓度、添加分子伴侣[4-7]以及融合表达[8-12]等等。本专利技术即采用多种新型的低分子量的标签蛋白与糖基转移酶进行融合表达，最终提高糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达。参考文献[1]BrandleJE,TelmerPG.Steviolglycosidebiosynthesis.Phytochemistry2007;68:1855-1863.[2]KaneJF.Effectsofrarecodonclustersonhigh-levelexpressionofheterologousproteinsinEscherichiacoli.Curr.Opin.Biotechnol.1995;6:494-500.[3]JhambK,SahooDK.ProductionofsolublerecombinantproteinsinEscherichiacoli:Effectsofprocessconditionsandchaperoneco-expressiononcellgrowthandproductionofxylanase.BioresourceTechnol.2012;123:135-143.[4]SchliekerC,BukauB,MogkA.PreventionandreversionofproteinaggregationbymolecularchaperonesintheE.colicytosol:implicationsfortheirapplicabilityinbiotechnology.J.Biotechnol.2002;96:13-21.[5]JhambK,JawedA,SahooDK.Immobilizedchaperones:Aproductivealternativetorefoldingofbacterialinclusionbodyproteins.ProcessBiochem.2008;43:587-597.[6]PeiXL,WangQY,MengLJ,etal.Chaperones-assistedsolubleexpressionandmaturationofrecombinantCo-typenitrilehydrataseinEscherichiacolitoavoidtheneedforalowinductiontemperature.J.Biotechnol.2015;203:9-16.[7]TongYJ,FengSS,XinY,etal.Enhancementofsolubleexpressionofcodon-optimizedThermomicrobiumroseumsarcosineoxidaseinEscherichiacoliviachaperoneco-expression.J.Biotechnol.2016;218:75-84.[8]HellmanJ,PaavilainenS,MantsalaP.ExpressioninE.coliandpurificationofintracellularproteinsbyfusiontocyclomaltodextringlucanotransferase.J.Biotechnol.1992;26:275-288.[9]AhnKY,SongJA,HahKY,etal.Heterologousproteinexpressionusinganovelstress-responsiveproteinofE.coliRpoAasfusionexpressionpartner.EnzymeMicrob.Tech.2007;41:859-866.[10]KimS,LeeSB.SolubleexpressionofarchaealproteinsinEscherichiacolibyusingfusion-partners.ProteinExpr.Purif.2008;62:116-119.[11]PasekM,BoeggemanE,RamakrishnanB,etal.Galectin-1asafusionpartnerfortheproductionofsolubleandfoldedhumanbeta-1,4-galactosyltransferase-T7inE.coli.Biochem.Bioph.Res.Co.2010;394:679-684.[12]Raran-KurussiS,KeefeK,WaughDS.PositionaleffectsoffusionpartnersontheyieldandsolubilityofMBPfusionproteins.ProteinExpr.Purif.2015;110:159-164。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对目前植物来源的糖基转移酶UGT76G1在大肠杆菌中表达会产生大量包涵体，实际可溶性表达很低的问题，提供一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法,采用多种新型的低分子量的标签蛋白与糖基转移酶进行融合表达，最终提高糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达。为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法，将标签蛋白基因与目标蛋白基因构建到表达载体上，导入到大肠杆菌中构建得到重组菌，重组菌诱导表达，标签蛋白与目标蛋白进行融合表达，从而提高糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达；所述标签蛋白基因为3’-磷酸腺苷-5’磷酸酶基因、2-氧代-3-脱氧-6磷酸葡萄糖酸醛缩酶基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法，其特征在于，将标签蛋白基因与目标蛋白基因构建到表达载体上，导入到大肠杆菌中构建得到重组菌，重组菌诱导表达，标签蛋白与目标蛋白进行融合表达，提高糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达；所述标签蛋白基因为3’‑磷酸腺苷‑5’磷酸酶基因、2‑氧代‑3‑脱氧‑6磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因或者抗终止作用因子基因中的至少一种，所述目标蛋白基因为植物来源糖基转移酶基因。

【技术特征摘要】
1.一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法，其特征在于，将标签蛋白基因与目标蛋白基因构建到表达载体上，导入到大肠杆菌中构建得到重组菌，重组菌诱导表达，标签蛋白与目标蛋白进行融合表达，提高糖基转移酶在大肠杆菌中的可溶性表达；所述标签蛋白基因为3’-磷酸腺苷-5’磷酸酶基因、2-氧代-3-脱氧-6磷酸葡萄糖酸醛缩酶基因或者抗终止作用因子基因中的至少一种，所述目标蛋白基因为植物来源糖基转移酶基因。2.根据权利要求1所述的一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法，其特征在于，将标签蛋白基因构建在表达载体的NdeI和HindIII之间，将目标蛋白构建在HindIII和EcoRI之间，且标签蛋白和目标蛋白的之间添加一组肠激酶酶切位点，蛋白序列为DDDDK。3.根据权所述利要求1所述的一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法，其特征在于，所述目标蛋白基因为甜叶菊来源的糖基转移酶基因，为GenBankaccessionno:AAR06912，基因序列见SEQ.No.1所示。4.根据权利要求1所述的一种增加植物来源糖基转移酶基因可溶性异源表达的方法，其特征在于，所述3’-磷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：李艳，陈量量，严明，陈可泉，郝宁，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32