与磷酸酶反应产生化学发光的化合物的中间体制造技术

本发明专利技术提供了能和磷酸酶反应产生化学发光的新的杂环化合物及其制备工艺和在其中有用的中间体。该化合物包括一个含有Ｎ，Ｏ或者Ｓ的并带有一个外向环的碳－碳双键的杂环系统。该双键的远侧碳末端被磷酸基和含有一个Ｏ或者Ｓ原子的基团取代。本发明专利技术还提供了新的组合物，其除了含有该杂环磷酸酯化合物外，还含有一种阳离子芳香族化合物（ＣＡＣ）。而在该组合物中加入ＡＣ可大大地增加化学发光的产生并改善检测灵敏度。而那些还含有阴离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂的组合物则可进一步改善检测灵敏度。该新的化学发光化合物和组合物可应用于发光的方法中，磷酸酶和酶抑制剂的检测中以及那些用酶标记的特异结合对的检测中。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请是申请号97190142.2、申请日1997年1月15日、题为“与磷酸酶反应产生化学发光的化合物、组合物和方法“的专利申请的分案申请。上述申请是同时待审的申请日为1996年1月16日的序号为08/585,090和申请日为1996年7月19日的序号为08/683,927的美国申请的部分继续。本专利技术涉及能和磷酸酶反应并发光的化学发光化合物。本专利技术特别涉及带有一个杂环基团和一个磷酸烯醇酯基团的化学发光化合物，而该磷酸烯醇酯基在用磷酸酶除去磷酸基并生成烯醇酯(盐)的基础上和氧发生反应生成一个羰基化合物并产生化学发光。本专利技术还涉及与磷酸酶反应而发光的组合物。该化学发光组合物包括含有一个杂环基和磷酸烯醇酯基的第一化合物以及在磷酸酯化合物和磷酸酶反应中起着增加光产生作用的第二化合物。本专利技术涉及通过磷酸酶和化学发光组合物反应而发光或者化学发光的方法。本专利技术尤其涉及这些方法的改进，而这些改进可以显著地增强光发射。本专利技术还涉及该化学发光反应以及组合物在测定磷酸酶的以及在免疫检测，核酸探针检测及其它类似的检测中测定磷酸酶标记的特异结合对的方法中的应用。本专利技术涉及与磷酸酶反应并产生化学发光的化学发光化合物的制备工艺。本专利技术涉及在本工艺中有用的新的中间体。本专利技术尤其涉及制备带有杂环基和烯醇磷酸酯基的化学发光化合物的工艺和中间体。该上述烯醇磷酸酯基在除去磷酸保护基的情况下和氧反应生成羰基化合物并产生化学发光。a．化学发光检测磷酸酶诸如碱性磷酸酯酶的水解酶经常在生物分子和诸如药物，激素，类固醇以及肿瘤标记物的其它重要被分析物的酶联检测中用作标记物。此外，诸如碱性磷酸酶(AP)和酸性磷酸酶(AcP)的磷酸酶本身就在人类和兽医学诊断中具有重要的临床意义。作为一种安全，方便和灵敏的检测这些酶的方法，化学发光法提供了一个定量测定样品中酶量或者酶标记的被分析物量或标记的被分析物的特异结合对象的量的方法。很多化学发光反应方案已发展成定量的，尤其是定量水解酶的水平。大部分的这些方案是复杂且昂贵，并需要多种酶或几种试剂。因而阻碍了大部分的此类方法应用于商业化的大批样品的测定。申请人的以参考文献形式完整地引入本专利技术的，同时待审的08/585,090号的美国专利申请，公开了带有一个磷酸烯醇酯基的杂环化合物和磷酸酶的化学发光反应。光发射因为阳离子表面活性剂的存在下而增加，从而可检测出10-18到10-19摩尔水平的磷酸酶。申请人的以参考文献形式完整地引入本专利技术的，同时待审的08/683,927号的美国专利申请，公开了使用阳离子芳香化合物(CAC′s)，使带有一个磷酸烯醇酯基的某种杂环化合物与磷酸酶的反应所发射的光的量显著增加。磷酸酶的检测限也因此而显著地降低。b．化学法和酶法激发的二氧四节环(Dioxetanes)带有一个保护苯酚基的激发基团的稳定的1,2-二氧四节环，在除去保护基的条件下，进行化学发光分解(A.P.Schaap,T.S.Chen,R.S.Handley,R.DeSilva，和B.P.Giri，四面体通讯(Tetrahedron Lett.),1155(1987)；A.P.Schaap,R.S.Handley，和B.P.Giri,Tetradron Lett.,935(1987)；A.P.Schaap,M.D.Sandison，和R.S.Handley，四面体通讯(Tetrahedron Lett.),1159(1987)；和A.P.Schaap，光化学和光生物学(Photochem Photobiol),475,50S(1988))。酶法激发的二氧四节环带有一个可用酶法除去的保护基所封闭的芳醚取代基。其在含水的缓冲液中和水解酶反应暴露出芳醚阴离子，而该阴离子按级数促进该二氧四节环的化学发光降解率。化学法激发的二氧四节环带有一个用保护基封闭的芳醚取代基，而该保护基可用简单的化学试剂除去。例如，用氢氧化物对乙酰二氧四节环脱保护，或，用氟化物对甲硅烷氧基二氧四节环脱保护。已公开了很多此类可激发二氧四节环，例如，美国专利4,857,652,5,068,339,4,952,707,5,112,960,5,220,005,5,326,882以及PCT申请WO96/24849,WO94/10258和WO94/26726。然而，一些可激发二氧四节环的固有的缺点是，其在无酶存在时通过缓慢的热分解或非-酶水解而有产生背景化学发光的趋势。c．鲁米诺(Luminol)衍生物鲁米诺的磷酸酯和NAG衍生物是众所周知的(K.Sasamoto,Y.Ohkura,化学药学杂志(Chem.Pharm.Bull.),38,1323-5(1991)；M.Nakazono,H.Nohta,K.Sasamoto,Y.Ohkura，分析科学(Anal.Sci.),8,779-83(1992))。用合适的酶处理该鲁米诺衍生物释放出鲁米诺，其再和铁氰化物反应而发光。d．荧光素衍生物磷酸酯和半乳糖苷的萤光荧光素衍生物是众所周知的(N.Ugarova,Y.Vosny,G.Kutuzova,I.Dementieva,生物发光和化学发光的最新展望(Biolum.and Chemilum.New Perspectives),P.Stanley和L.J.Kricka,eds.,Wiley,Chichester,511-4(1981)；W.Miska,R.Gerger，生物发光和化学发光杂志(J.Biolumin.Chemilumin.),4,119-28(1989))。用合适的酶处理萤光荧光素释放萤光荧光素，其再和荧光素酶和ATP反应而发光。e．涉及还原剂产生的反应用碱性磷酸酶催化磷酸酯而产生还原剂的化学发光方法已有报道。(M.Maeda,A.Tsuji,K.H.Yang,S.Kamada，生物发光和化学发光的目前状况(Bioluim.and Chemilum.Current Status),119-22(1991)；M.kitamura,M.Maeda,A.Tsuji，生物发光和化学发光杂志(J.Biolumin.Chemilumin.),10,1-7(1995)；H.Sasamoto,M.Maeda,A.Tsuji，分析化学学报(Anal.Chim.Acta),306,161-6(1995))。该还原剂再引起氧和荧光素间的反应，而从荧光素中发生光。典型的还原剂包括维生素C，丙三醇，NADH，二羟基丙酮，氢化可的松和苯甲酰甲醇。这些方法不同于本专利技术，本专利技术涉及从脱保护的荧光化合物而不是光泽精中发光。已知的用酶法产生的，和光泽精反应的还原剂的方法都要求了酶和磷酸酯化合物间的单独的预先温育步骤。这便增添了额外的复杂性和试验时间。美国专利5,589,328(Mahant)公开了一个化学发光反应，其中的3-吲哚氧基酯，硫代-3-吲哚氧基酯和苯并呋喃酯用酶水解并产生超氧化物。通过加入化学发光产生剂，比如光泽精，而增强发光效应。光泽精通过和超氧化物反应产生化学发光。f．酶联方法已知有很多其它的通过酶联反应而检测诸如磷酸酯酶的水解酶的方法和试验。此类方法汇编于A.Tsnji,M.Maeda,H.Arakawa，分析科学(Anal.Sci.),5,497-506(1989)。其它的双酶化本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种式Ⅸ化合物：＊＊＊ Ⅸ式中的Ｈｅｔ是至少含有一个含有至少一个Ｎ或者Ｓ原子的五元或者六元环的杂环系统，Ｚ选自Ｏ和Ｓ原子，Ｒ↓［６］是允许化学发光产生的有机基团而ｙ则是可除去的以便生成磷酸盐化合物的保护基。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：哈希姆阿克哈文塔夫蒂，扎拉阿格哈瓦尼，伦纳卡戴西尔瓦，
申请(专利权)人：鲁米根公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]