本发明专利技术提供调控植物开花的银杏MADS‑box类转录因子GbMADS9基因。该基因是以银杏雌花总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR方法扩增而获得的。其优点是：GbMADS9基因可调控植物开花，缩短植物童期，同时受GA3、ABA、盐胁迫、干旱胁迫和冷害胁迫的诱导，超表达GbMADS9基因可增强植物对渗透胁迫的耐受性；可应用于植物花期的调控。
Regulation of flowering of Ginkgo biloba MADS box transcription factor gene GbMADS9 and its encoding protein and Application
The present invention provides regulation of plant flowering of Ginkgo biloba MADS box transcription factor GbMADS9 gene. The cDNA gene was obtained by reverse transcription of total RNA from female flower of Ginkgo biloba as a template, which was amplified by PCR method. Its advantages are: GbMADS9 gene regulation of plant flowering plants, shorten the juvenile period, at the same time induced by GA3, ABA, salt stress, drought stress and cold stress, and over expression of GbMADS9 gene can enhance plant tolerance to osmotic stress; can be used in the regulation of flowering plants.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物基因工程领域，具体地说是一种调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因及其编码蛋白与应用。
技术介绍
银杏(GinkgobilobaL.)原产我国，银杏科银杏属，落叶乔木，雌雄异株，又称白果树、公孙树。银杏是目前世界上最古老的孑遗植物，有着“活化石”之称，广泛应用于园林景观、医药、食品、保健等领域。由于银杏的童期非常长，给银杏优良品种的育种带来了严重的障碍，使得银杏许多经济效益和社会价值受到很大程度的限制。近年来通过基因工程手段对木本植物开花相关基因的遗传改造，在缩短木本植物的童期研究中已取得了一定的成效。因此，利用基因工程技术缩短童期有望在银杏上实现。MADS-box基因家族编码的转录因子(TF)与一个保守的DNA结构域结合，称为MADS-box。这些基因在生物有机体中普遍存在，具有广泛的调节功能，如在动物心肌发育，酵母中信息素反应，精氨酸代谢和控制植物的生长和发育等。植物中MADS-box基因的大小和功能已经在多种植物中被研究报道，如拟南芥，水稻，矮牵牛，番茄，玉米，高粱，梅花和兰花。这些研究表明MADS-box基因扮演着许多重要的调节作用，包括裂区的分化形成，胚胎的发育，果实的成熟，营养器官发育，控制开花时间，以及调控花的分生组织和器官的形成等。此外，一些MADS-box基因也参与调控次生代谢产物的生物合成途径和非生物胁迫的耐受性。银杏中已有一些MADS-box基因被报道。Jager等人首先在银杏中分离出33个MADS-box基因。系统发育分析表明，这些基因中的一个GBM5基因，是拟南芥AGAMOUS(AG)MADS-box基因同源基因。Lovisetto等也确认BsisterMADS-box(GBM10)基因来自银杏。GBM10在烟草中的过表达研究表明，其在胚珠和种子发育中起重要作用。最近报道的GbMADS2和GbSEP基因，分别属于AG分支和SEP分支，它们可能参与生殖器官的发育。但是，银杏中MADS-box基因调控开花时间和胁迫响应的功能未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于一方面提供一种调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因，如序列表SEQIDNO:1所示。是从“家佛手”银杏中分离克隆的一段完整编码区的cDNA片段，对这个基因编码的蛋白序列进行分析可知，它属于Bsister类MADS-box蛋白的GGM13分支，命名为GbMADS9；可调控植物开花，增强植物对渗透胁迫的抗逆性。本专利技术第二方面：调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因是以银杏雌花总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR方法扩增而获得的具有银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因全长cDNA序列的基因片段，如序列表SEQIDNO:2所示。本专利技术第三方面：调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因编码的蛋白，其氨基酸序列为序列表SEQIDNO:3所示。本专利技术第四方面是提供一种含有上述基因的克隆载体；本专利技术第五方面是提供一种含上述基因的表达载体；本专利技术第六方面是提供所述调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因在调控植物开花中的应用，将所述基因用花絮浸染法导入拟南芥植物中，以调控植物开花时间。本专利技术第七方面是提供一种与上述第二方面所述GbMADS9基因全长cDNA序列的基因片段同源的cDNA序列。本专利技术第八方面是提供所述调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因在调控植物渗透胁迫耐受性中的应用。调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子基因GbMADS9及其编码蛋白与应用，其优点是：GbMADS9基因可调控植物开花，缩短植物童期，同时受GA3、ABA、盐胁迫、干旱胁迫和冷害胁迫的诱导，超表达GbMADS9基因可增强植物对渗透胁迫的耐受性；可应用于植物花期的调控。附图说明图1A为将GbMADS9基因的蛋白质与同源MADS-box蛋白质的氨基酸序列比对的结果；图1B为GbMADS9基因组结构中的外显子与内含子；图2为MADS-box蛋白质序列比对构建的系统发育进化树；图3为GbMADS9的Southern杂交分析；图4A为银杏不同组织中GbMADS9的表达模式；图4B为银杏果的生长发育过程中GbMADS9转录水平的变化；图5A、5B、5C分别为植物激素GA3，IAA和ABA处理后GbMADS9的表达模式；图6A、6B、6C分别为GbMADS9在盐胁迫、干旱胁迫、冷害胁迫的表达模式；图7为转基因和野生型拟南芥植株的内源开花相关基因表达谱；图8为GbMADS9转基因植物和WT植物的生长；图9A、9B、9C均为渗透胁迫对WT和GbMADS9过表达转基因植株叶片生理特性的影响；图10A、10B、10C、10D均为在渗透胁迫下GbMADS9过表达转基因植株和WT植株对抗氧化酶活性的影响。具体实施方式下面结合具体实施案例，进一步阐述本专利技术。这些实施案例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施案例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例一银杏GbMADS9基因的获得S1、银杏雌花总RNA的提取：S11、取1g新鲜的银杏雌花，在液氮中充分研磨后转入10ml遇冷的离心管中，加入4mlCTAB提取液，60℃水浴30min；S12、再向步骤S1获得的物质加入4ml氯仿异戊醇溶液混匀，冰浴5min后，在4℃,12000rpm条件下离心10min，吸取上清液，加入8MLiCl混匀，-80℃条件下静置60min；然后在4℃,12000rpm条件下离心10min；弃上清，70％酒精洗涤两次，离心管倒置10min；S13、再加入DNase至步骤S12经处理后的溶液中消化45min后，重复S12步骤；最后加入100μLDEPC水，即得到银杏雌花RNA。S2、步骤S1制备的银杏RNA反转录获得cDNA；第一链cDNA的合成使用Clontech公司的PowerScriptTMReverseTranscriptase试剂盒，方法参照反转录试剂盒说明书。S3、GbMADS9的克隆：使用RT-PCR技术，以银杏雌花总RNA反转录的cDNA为模板，进行扩增反应，目的条带胶回收，将回收产物克隆到pMD18-T载体中并测序，即得到银杏GbMADS9基因组序列全长(见序列表)；用于RT-PCR扩增反应的GbMADS9cDNA全长的引物为：MADS9-FP：5'-CTCAATCAGTCCGCTTTATCTC-3'MADS9-RP：5'-GAATACTGTGTAGTATTTTAAATAT-3'RT-PCR反应体系：TaqDNA聚合酶0.5μL，10×PCRbuffer(Mg2+)2.5μL，dNTP(10mM)0.5μL，MADS9-FP(10mM)1μL，MADS9-RP(10mM)1μL，ddH2018.5μL，总体积25μL；反应条件：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃90s，33个循环；72℃，10min,4℃，10min。实施例二银杏基因信息与同源性的分析本专利技术银杏GbMADS9基因组序列长度为2820bp，序列中含有684bp的最大开放阅读狂，本文档来自技高网...
【技术保护点】
调控植物开花的银杏MADS‑box类转录因子GbMADS9基因，其特征在于：该基因序列如序列表SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因，其特征在于：该基因序列如序列表SEQIDNO:1所示。2.根据权利要求1所述调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因，其特征在于：调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因是以银杏雌花总RNA反转录得到的cDNA为模板，经PCR方法扩增而获得的具有银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因全长cDNA序列的基因片段，如序列表SEQIDNO:2所示。3.一种保护权利要求1或2所述调控植物开花的银杏MADS-box类转录因子GbMADS9基因编码的蛋...
【专利技术属性】
技术研发人员：许锋，杨芬，叶家保，张威威，廖咏玲，
申请(专利权)人：长江大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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