一种C末端为酪氨酸的海带小分子ACE抑制肽制备方法技术

本发明专利技术旨在提供一种以海藻粗蛋白为原料，通过混合蛋白酶生物转化制备以酪氨酸（Tyr）为C末端的小分子ACE抑制肽的方法，该方法简便易行，具有较高的制备效率，且利于扩大生产，为海藻类降血压功能性制品的开发提供一种可行思路。制备具有较高ACE抑制活性的C末端为Tyr的小分子降血压肽，降血压效果显著。所制备的小分子降血压肽为白色粉末，易溶于水，且易吸收、毒副作用小、安全性高，可作为降血压防治药物的一种高效原料。

Method for preparing small molecule ACE inhibitory peptide of C terminal tyrosine

The invention aims at providing a seaweed protein as raw material, through mixing proteinase biotransformation preparation with tyrosine (Tyr) method for small molecule ACE terminal of C inhibitory peptides, this method is simple and has high preparation efficiency, and conducive to the expansion of production, to provide a feasible way for the development of seaweed drop the blood pressure of functional products. The preparation of low molecular weight antihypertensive peptides with ACE inhibitory activity of C at the end of Tyr was achieved. The prepared small molecule antihypertensive peptide is white powder, soluble in water, easy to absorb, small toxic and side effect, high safety, and can be used as a high effective material for preventing and treating blood pressure.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物血管紧张素转换酶（ACE）抑制寡肽制备领域，具体涉及一种以海带粗蛋白为原料生物转化制备以酪氨酸（Tyr）为C末端的小分子ACE抑制肽的方法。
技术介绍
我国的海带等海藻产量、加工量巨大。然而海带等海藻加工多以中小型企业为主，加工设备与生产技术较为落后，产品品种少，质量参差不齐，集中于初级加工产品形式，导致海藻类产品的价格及海藻企业的利润也相应较低，产值不容乐观。资料显示，海带等海藻的加工副产物中含有5%～20%的蛋白质，这些副产物未经加工被直接遗弃，造成了资源的极大浪费；若能变废为宝，将其深度开发为具有降血压活性的ACE抑制肽，将大大提高海藻类生物的附加值。大多数食用蛋白可通过蛋白酶酶解方法获取具有ACE抑制活性的降血压肽，且其降血压功效已通过动物实验或临床试验证实。研究结果显示，C末端含有Tyr的小分子活性肽具有较强的降血压活性，因此制备C末端含Tyr的小分子活性肽成为制备ACE抑制肽的特征条件。蛋白酶具有专一性，不同蛋白酶的酶切位点不同，导致酶解产物各不相同，因此选择合适的蛋白酶将有助于酶解产生更多、活性更强的ACE抑制肽。据文献资料显示，使用单一蛋白酶作用于蛋白会使蛋白水解液中多肽的相对分子质量较大，且分布范围较广；而高活性的ACE抑制肽的相对分子质量较小且有一定的范围。以该理论为出发点，混合蛋白酶酶解液中得到的ACE抑制肽的活性将远远高于单一蛋白酶酶解液的活性。碱性蛋白酶是一种内切蛋白酶，倾向于催化裂解不带电荷的侧链氨基酸（如phe，Tyr，Trp等）的C端肽键，末端形成具有较强ACE抑制活性的疏水性氨基酸，且酶解速度较快。胰蛋白酶能水解N端的Lys，得到具有较高ACE抑制率的N端为Lys的系列肽段，但是酶解速度较慢。木瓜蛋白酶具有较宽的底物特异性，可切开全部蛋白质分子内部肽键，生成小分子多肽类，以便碱性蛋白酶与胰蛋白酶专一性切割为高活性的降血压小肽。将此三种蛋白酶混合理论上可高效制备C末端含有Tyr的小分子降血压活性肽。然而，目前国内外尚未发现有关海藻类食物源C末端含有Tyr的小分子降血压活性肽的混合酶解转化制备工艺研究。本专利技术针对以上关键技术进行探究优化，以从海藻粗蛋白中高效制备C末端含有Tyr的小分子降血压活性肽。利用多酶体系进行海带蛋白生物转化，分步优化生物酶自身酶解特性和最佳酶解工艺参数，进而确定海带小分子ACE抑制肽的最佳制备工艺。以期为功能性食品领域提供一种质优价廉的降血压原料制备方法，同时为海带等海藻的高附加值研究开发提供一定的理论基础和实践指导。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种以海带等海藻粗蛋白为原料，通过混合蛋白酶生物转化制备以酪氨酸（Tyr）为C末端的小分子ACE抑制肽的方法，该方法简便易行，具有较高的制备效率，且利于扩大生产，为海带等海藻类降血压功能性制品的开发提供一种可行思路。针对以上技术问题，本专利技术提供一种以酪氨酸为C末端的海带小分子ACE抑制肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）原料预处理：新鲜海带或海带加工下脚料清洗去除泥沙、杂质，乙醚脱脂、醇提除去甘露醇并醇沉除去多糖大分子，在60℃条件下烘干至恒重，粉碎后过100~200目筛，备用；（2）海带粗蛋白的制备：取步骤（1）制备的海带粉末，用pH值9.0～9.5的缓冲液，按固液体积比1:35～1:50溶解，在45～60℃下匀速搅拌提取5～7h，碱性条件下溶解海带蛋白，提取结束后，用1mol/L的盐酸将pH调节到4.3～4.7沉淀海带蛋白，在12000r/min条件下离心10～15min，缓慢洗涤沉淀，冷冻干燥后制得海带粗蛋白；（3）多酶体系生物转化：取步骤（2）制得的海带粗蛋白，按照固液体积比1:40～1:60加入pH为7.0～8.0的缓冲液作为提取液，加入3～5wt%的混合酶，所述混合酶由碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶按照1:1:1～3:2:1的摩尔比混合而成；将反应体系置于50～65℃，500～800r/min的水浴摇床中匀速振荡反应5～8h，反应结束后置于105℃的恒温水浴锅中灭酶15～20min，在10000r/min的高速离心机中离心10～15min，上清液即为海带粗蛋白生物转化液；（4）超滤：将步骤（3）所得到的生物转化液通过1000Da超滤膜去除大分子，得到含C端为Tyr的ACE抑制小分子肽的海带生物转化液。（5）ACE抑制活性检测：将步骤（4）所得含C端为Tyr的ACE抑制小分子肽的海带生物转化液过0.22µm的滤膜后采用高效液相色谱法进行体外ACE抑制活性检测，检测该生物转化液的降血压活性。（6）冷冻干燥：将生物转化液冷冻干燥后制得含C末端为Tyr的小分子ACE抑制肽冻干粉末。所述的一种以酪氨酸为C末端的海带小分子ACE抑制肽粉末中主要含C末端为Tyr的小分子降血压肽，主要有KY，GKY，SKTY，AKY，AKYSY，KKFY，FY，KFKY八种，且该种抑制肽粉末的ACE抑制活性的IC50值为2.18～23.43mg/mL。本专利技术的优点及益处在于：1.本专利技术利用我国高产量、低利用率的海带等海藻资源，多酶体系下生物转化制备具有较高ACE抑制活性的C末端为Tyr的小分子降血压肽，降血压效果显著，作用位点明确。2.本专利技术所制备的小分子降血压肽冷冻干燥后为白色粉末，易溶于水，且易吸收、毒副作用小、安全性高，可作为降血压保健品及预防药物的一种食品级天然原料。3.本专利技术利用酶工程技术，通过混合蛋白酶专一性生物转化方法，对海带等海藻粗蛋白进行深入的开发利用，高效制备具有降血压功效的小分子多肽物质；并通过分析检测技术检测得知该小分子多肽物质多为以酪氨酸（Tyr）为C末端的小分子ACE抑制肽，其中主要为KY，GKY，SKTY，AKY，AKYSY，KKFY，FY，KFKY八种小分子降血压肽。4.本专利技术的ACE抑制肽粉末的主要成分含有八种具有降血压活性的小分子肽（结构清楚，作用位点明确，详见附图），具有较高的ACE抑制活性，且其在消化道中难以被进一步消化酶解，可以在小肠中直接吸收利用，在人体中发挥较好的降血压功效，为海藻降血压功能性制品的开发提供了新的思路。附图说明图1所用生物降解酶特性各影响因素交互作用的响应曲面图和等高线图图2降血压肽酶解制备工艺各影响因素交互作用的响应曲面图和等高线图图3各种小分子降血压活性肽与ACE的结合构象图：其中，图3A为小肽FY的结合构象图；图3B为小肽KY的结合构象图；图3C为小肽AKY的结合构象图；图3D为小肽GKY的结合构象图；图3E为小肽KFKY的结合构象图；图3F为小肽KKFY的结合构象图；图3G为小肽STKY的结合构象图；图3H为小肽AKYSY的结合构象图图4小分子降血压肽FY与ACE受体蛋白结合构象。具体实施例实施例1：一种海带粗蛋白生物转化制备以酪氨酸（Tyr）为C末端的小分子ACE抑制肽的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）原料预处理：新鲜海带或海带加工下脚料清洗去除泥沙、杂质，乙醚脱脂、醇提除去甘露醇并醇沉除去多糖大分子，在60℃条件下烘干至恒重，粉碎后过200目筛，备用；（2）海带粗蛋白的制备：取步骤（1）制备的海带粉末，用pH值9.5的缓冲液，按固液体积比1:50溶解，在45℃下匀速搅拌提取5h，碱性条件下溶解海带蛋白，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种C末端为酪氨酸的海带小分子ACE抑制肽制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）原料预处理：新鲜海带或海带加工下脚料清洗去除泥沙、杂质，乙醚脱脂、醇提除去甘露醇并醇沉除去多糖大分子，在60℃条件下烘干至恒重，粉碎后过100~200目筛，备用；（2）海带粗蛋白的制备：取步骤（1）制备的海带粉末，用pH值9.0～9.5的缓冲液，按固液体积比1:35～1:50溶解，在45～60℃下匀速搅拌提取5～7 h，碱性条件下溶解海带蛋白，提取结束后，用1 mol/L的盐酸将pH调节到4.3～4.7沉淀海带蛋白，在12000 r/min条件下离心10～15 min，缓慢洗涤沉淀，冷冻干燥后制得海带粗蛋白；（3）多酶体系生物转化：取步骤（2）制得的海带粗蛋白，按照固液体积比1:40～1:60加入pH为7.0～8.0的缓冲液作为提取液，加入3～5wt%的混合酶，将反应体系置于50～65℃，500～800 r/min的水浴摇床中匀速振荡反应5～8 h，反应结束后置于105℃的恒温水浴锅中灭酶15～20 min，在10000 r/min的高速离心机中离心10～15 min，上清液即为海带粗蛋白生物转化液；（4）超滤：将步骤（3）所得到的生物转化液通过1000 Da超滤膜去除大分子，得到含C端为Tyr的ACE抑制小分子肽的海带生物转化液；（5）冷冻干燥：将生物转化液冷冻干燥后制得含C末端为Tyr的小分子ACE抑制肽冻干粉末。...

【技术特征摘要】
1.一种C末端为酪氨酸的海带小分子ACE抑制肽制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）原料预处理：新鲜海带或海带加工下脚料清洗去除泥沙、杂质，乙醚脱脂、醇提除去甘露醇并醇沉除去多糖大分子，在60℃条件下烘干至恒重，粉碎后过100~200目筛，备用；（2）海带粗蛋白的制备：取步骤（1）制备的海带粉末，用pH值9.0～9.5的缓冲液，按固液体积比1:35～1:50溶解，在45～60℃下匀速搅拌提取5～7h，碱性条件下溶解海带蛋白，提取结束后，用1mol/L的盐酸将pH调节到4.3～4.7沉淀海带蛋白，在12000r/min条件下离心10～15min，缓慢洗涤沉淀，冷冻干燥后制得海带粗蛋白；（3）多酶体系生物转化：取步骤（2）制得的海带粗蛋白，按照固液体积比1:40～1:60加入pH为7.0～8.0的缓冲液作为提取液，加入3～5wt%的混合酶，将反应体系置于50～65℃，500～800r/min的水浴摇床中匀速振荡反应5～8h，反应结束后置于105℃的恒温水浴锅中灭酶15～20min，在10000r/m...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈继承，王洁，臧盈盈，葛慧芳，
申请(专利权)人：福建农林大学，
类型：发明
国别省市：福建;35