修饰的核苷酸连接基制造技术

本申请的一些实施方案涉及在合成测序应用中用于增加核苷酸掺入的效率的新的修饰的核苷酸连接基。本申请还提供了制备这些修饰的核苷酸连接基的方法。

Modified nucleotide linker

A number of embodiments of the present invention relate to novel modified nucleotide links for increasing the efficiency of nucleotide incorporation in synthetic sequencing applications. The invention also provides a method for preparing the modified nucleotide linker.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请的一些实施方案涉及用于在DNA测序和其它诊断应用(例如合成测序)中增加核苷酸掺入的新核苷或核苷酸连接基。
技术介绍
分子研究的进展部分地是通过改进用于表征分子或其生物反应的技术产生的。具体地，核酸DNA和RNA的研究已经从研发用于序列分析和杂交事件的技术中受益。已改进核酸研究的技术的一个实例是开发了固定化核酸的制备阵列。这些阵列通常具有固定在固体支持材料上的多核苷酸的高密度基质。参见，例如Fodor等,TrendsBiotech.12：19-26,1994，其描述了使用化学敏化的玻璃表面组装不同核酸的方法，所述化学敏化玻璃表面由掩模保护，但在限定的区域暴露以允许连接适当修饰的核苷酸亚磷酰胺。制备的阵列也可以通过将已知的多核苷酸“点样”到固体支持物上的预定位置的技术来制造(例如，Stimpson等,Proc.Natl.Acad.Sci.92：6379-6383,1995)。确定与阵列结合的核酸的核苷酸序列的一种方法称为“合成测序”或“SBS”。用于测定DNA的核苷酸序列的这种技术理想地需要控制性(即一次一个)掺入与被测序的核酸相对的正确互补核苷酸。这允许通过在多个循环中添加核苷酸来进行精确测序，因为一次测序一个核苷酸残基，从而防止掺入不受控制的核苷酸序列。在去除标记部分和随后的下一轮测序之前，使用与其连接的合适标记来读取每个掺入的核苷酸。因此，在核酸测序反应的情形下，希望能够在合成测序过程中增加核苷酸掺入的速率，从而可以提高测序方法的效率。专利技术概述本文公开的一些实施方案涉及通过连接基共价连接到荧光团的核苷或核苷酸，其中所述连接基包含式(I)或(II)的结构，或两者的组合：每个R1和R2独立地选自氢或任选取代的C1-6烷基；R3选自氢、任选取代的C1-6烷基、-NR5-C(＝O)R6或-NR7-C(＝O)-OR8；R4选自氢或任选取代的C1-6烷基；每个R5和R7独立地选自氢、任选取代的C1-6烷基、任选取代的苯基、或任选取代的C7-12芳烷基；每个R6和R8独立地选自任选取代的C1-6烷基、任选取代的苯基、任选取代的C7-12芳烷基、任选取代的C3-7环烷基、或任选取代的5至10元杂芳基；中的每个亚甲基重复单元任选被取代；X选自亚甲基(CH2)、氧(O)或硫(S)；m为0至20的整数；n为1至20的整数；和p为1至20的整数。在一些实施方案中，荧光团标记的核苷或核苷酸包含式(I)的结构，其不具有以下结构：本文公开的一些实施方案涉及通过连接基共价连接到荧光团的核苷或核苷酸，其中所述连接基包含式(III)的结构：其中L1不存在或包括式(I)或(II)中所述的任一连接基、或保护基，或其组合；L2选自任选取代的C1-20亚烷基、任选取代的C1-20杂亚烷基、被取代的芳基中断的任选取代的C1-20亚烷基、或被取代的芳基中断的任选取代的C1-20杂亚烷基；L3选自任选取代的C1-20亚烷基、或任选取代的C1-20杂亚烷基；RA选自氢、氰基、羟基、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷氧基或叠氮基，且其中的至少一个重复单元包括叠氮基；Z选自氧(O)或NRB；每个RB和RC独立地选自氢或任选取代的C1-6烷基；且k为1至50的整数。本文公开的一些实施方案涉及包含标记的核苷或核苷酸的试剂盒，所述核苷或核苷酸含有在荧光团与核苷或核苷酸之间的连接基，其中所述连接基包含式(I)、(II)或(III)中任一结构，或其组合。本文公开的一些实施方案涉及用于修饰核苷或核苷酸的试剂，其包含荧光团和连接基，其中所述连接基包含式(I)、(II)或(III)中任一结构，或其组合。本文公开的一些实施方案涉及用于检测已经掺入到多核苷酸中的核苷的方法，所述方法包括：(a)将包含连接基的标记的核苷或核苷酸掺入到多核苷酸中；和(b)检测步骤(a)中掺入的所述标记的核苷或核苷酸的荧光信号，其中所述连接基包含式(I)、(II)或(III)中任一结构，或其组合。在一些实施方案中，所述方法还包括：提供模板核酸链和部分杂交的核酸链，其中步骤(a)将至少一个核苷或核苷酸掺入杂交链，所述核苷或核苷酸与模板链的相应位置的核苷或核苷酸互补，且其中步骤(b)鉴定了掺入的核苷或核苷酸的碱基，从而指示模板链的互补核苷或核苷酸的身份。本文公开的一些实施方案涉及对模板核酸分子测序的方法，所述方法包括：将一个或多个标记的核苷酸掺入到与模板核酸互补的核酸链中；确定存在于一个或多个掺入的标记核苷酸中的碱基的身份，以确定模板核酸分子的序列；其中通过检测由所述标记的核苷酸产生的荧光信号来确定存在于所述一个或多个标记的核苷酸中的碱基的身份；并且其中至少一个掺入的标记核苷酸包含如上所述的连接基，其中所述连接基包含式(I)、(II)或(III)中任一结构，或其组合。在一些实施方案中，在每个核苷酸掺入步骤后确定存在于一个或多个核苷酸中的碱基的身份。附图说明图1A示出了标准的标记核苷酸的部分连接基团结构。图1B示出了图1A的标记的核苷酸，其具有可插入到图1A的标准连接基团中的两种可能的连接基125和130。图2显示使用图1A的标记核苷酸和图1B的经修饰的标记核苷酸的核苷酸掺入速率的图。图3A-3E示出了可插入到图1A的标准连接基团中的另外的连接基的结构式。图4显示用于评价图1B的125插入物和图3B的315插入物对测序质量影响的双染料测序运行的数据表。图5A和5B示出了使用连接基插入物125和315时，图4的测序运行的读数1的错误率图和读数2的错误率图。图6显示用于评估图1B的125插入物和图3A的310插入物对测序质量影响的测序运行的数据表。图7A和7B示出了使用连接基插入物125时，图6的测序运行的读数1的错误率图和读数2的错误率图。图8A显示了标准的LN3连接基结构的一个实例。图8B、8C和8D显示了图8A的LN3连接基的修饰结构的三个实例。图8E示出了将保护基插入到图8D的连接基中。图9A是显示在具有SS-连接基的ffA中出现杂质的色谱图。图9B是对比具有SS-连接基和AEDI-连接基的ffA的稳定性的表格。图9C是显示在IMX60°中22小时具有SS-连接基和AEDI-连接基的ffA的对比色谱图，其再次显示SS连接基出现杂质。图10A、10B和10C显示了在连接基改变的溶液中核苷酸掺入速度的意外增加。图10A是显示在1μM的掺入速率图。图10B显示列表的结果。图10C图示了具有NR550S0的AEDI和SS连接基。图11A显示了具有不同A-550S0(相同浓度)的V10组合的散点图。图11B显示了溶液中的KcatFFA连接基。图12A和12B显示对于M111、Human550共2x151个循环的测序指标。优选实施方案的详细描述本文公开的一些实施方案涉及通过连接基共价连接到荧光团的核苷或核苷酸，其中所述连接基包含下式(I)或(II)，或其组合的结构，其中变量的定义如上定义。在一些式(I)结构的实施方案中，R1为氢。在一些其他实施方案中，R1为任选取代的C1-6烷基。在一些这样的实施方案中，R1为甲基。在本文所述的式(I)的R1的任何实施方案中，R2是氢。在一些其他实施方案中，R2为任选取代的C1-6烷基。在一些这样的实施方案中，R2是甲本文档来自技高网...

【技术保护点】
通过连接基共价连接到荧光团的核苷或核苷酸，其中所述连接基包含式(I)或(II)的结构，或两者的组合：其中R1选自氢或任选取代的C1‑6烷基；R2选自氢或任选取代的C1‑6烷基；R3选自氢、任选取代的C1‑6烷基、‑NR5‑C(＝O)R6或‑NR7‑C(＝O)‑OR8；R4选自氢或任选取代的C1‑6烷基；每个R5和R7独立地选自氢、任选取代的C1‑6烷基、任选取代的苯基、或任选取代的C7‑12芳烷基；每个R6和R8独立地选自任选取代的C1‑6烷基、任选取代的苯基、任选取代的C7‑12芳烷基、任选取代的C3‑7环烷基、或任选取代的5至10元杂芳基；中的每个亚甲基重复单元任选被取代；X选自亚甲基(CH2)、氧(O)或硫(S)；m为0至20的整数；n为1至20的整数；和p为1至20的整数。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.08 GB 1414098.21.通过连接基共价连接到荧光团的核苷或核苷酸，其中所述连接基包含式(I)或(II)的结构，或两者的组合：其中R1选自氢或任选取代的C1-6烷基；R2选自氢或任选取代的C1-6烷基；R3选自氢、任选取代的C1-6烷基、-NR5-C(＝O)R6或-NR7-C(＝O)-OR8；R4选自氢或任选取代的C1-6烷基；每个R5和R7独立地选自氢、任选取代的C1-6烷基、任选取代的苯基、或任选取代的C7-12芳烷基；每个R6和R8独立地选自任选取代的C1-6烷基、任选取代的苯基、任选取代的C7-12芳烷基、任选取代的C3-7环烷基、或任选取代的5至10元杂芳基；中的每个亚甲基重复单元任选被取代；X选自亚甲基(CH2)、氧(O)或硫(S)；m为0至20的整数；n为1至20的整数；和p为1至20的整数。2.根据权利要求1的核苷或核苷酸，其中R1为甲基。3.根据权利要求1或2的核苷或核苷酸，其中R2为氢。4.根据权利要求1或2的核苷或核苷酸，其中R2为任选取代的C1-6烷基。5.根据权利要求4的核苷或核苷酸，其中R2为甲基。6.根据权利要求1-5中任一项的核苷或核苷酸，其中m为0。7.根据权利要求1-5中任一项的核苷或核苷酸，其中m为1。8.根据权利要求1-7中任一项的核苷或核苷酸，其中n为1。9.根据权利要求1的核苷或核苷酸，其中式(I)的结构也由式(Ia)表示：10.根据权利要求1的核苷或核苷酸，其中R3为任选取代的C1-6烷基。11.根据权利要求10的核苷或核苷酸，其中R3为甲基。12.根据权利要求1的核苷或核苷酸，其中R3为-NH-C(＝O)R6。13.根据权利要求12的核苷或核苷酸，其中R6为甲基。14.根据权利要求1的核苷或核苷酸，其中R3为-NH-C(＝O)OR8。15.根据权利要求14的核苷或核苷酸，其中R8为叔丁基。16.根据权利要求1、10至15中任一项所述的核苷或核苷酸，其中R4为氢。17.根据权利要求1、10至15中任一项所述的核苷或核苷酸，其中R4为任选取代的C1-6烷基。18.根据权利要求17的核苷或核苷酸，其中R4为甲基。19.根据权利要求1、10至18中任一项所述的核苷或核苷酸，其中X为亚甲基。20.根据权利要求1、10至18中任一项所述的核苷或核苷酸，其中X为O。21.根据权利要求1、10至18中任一项所述的核苷或核苷酸，其中X为S。22.根据权利要求1、10至21中任一项所述的核苷或核苷酸，其中p为1。23.根据权利要求1、10至21中任一项所述的核苷或核苷酸，其中p为2。24.根据权利要求1的核苷或核苷酸，其中式(II)的结构也由式(IIb)、(IIc)、(IId)、(IIe)或(IIf)所代表：25.根据权利要求1至24中任一项所述的核苷或核苷酸，其中所述核苷或核苷酸连接到连接基的左侧。26.通过连接基共价连接到荧光团的核苷或核苷酸，其中所述连接基包含式(III)的结构：其中：L1不存在或包括权利要求1-24中任一项所述的连接基、或保护基，或其组合；L2选自任选取代的C1-20亚烷基、任选取代的C1-20杂亚烷基、被取代的芳基中断的任选取代的C1-20亚烷基、或被取代的芳基中断的任选取代的C1-20杂亚烷基；L3选自任选取代的C1-20亚烷基、或任选取代的C1-20杂亚烷基；RA选自氢、氰基、羟基、卤素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C1-6卤代烷基、C1-6卤代烷...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓琳，刘小海，
申请(专利权)人：伊卢米纳剑桥有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB