一种黄病毒人源单克隆抗体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种黄病毒人源单克隆抗体及应用，属于医药技术领域。本发明专利技术获得了3个可以与ZIKV‑E蛋白结合的抗体并确定了3个抗体的结合位点。本发明专利技术的3株抗体与已经报道的ZIKV抗体序列完全不同，是3个新发现的抗体。这三株抗体与ZIKV‑E的结合常数分别为39.9pM(Z5)，44.7pM(Z6)和200pM(Z7)，说明三株人源抗体均有很强的寨卡病毒E蛋白结合能力。通过竞争实验，三株抗体结合的位点都与2A10G6存在竞争关系，说明三株抗体结合位点在FL附近，而黄病毒科的E蛋白在FL处高度保守。本发明专利技术的抗体有效检测常见的黄病毒科的病毒：寨卡病毒，登革1‑4型以及黄热病毒的感染，巨大的临床检测及基础研究的应用价值。

A flavivirus human monoclonal antibody and its application

The invention discloses a flavivirus human monoclonal antibody and application, which belongs to the technical field of medicine. The invention won the 3 can be combined with ZIKV E protein antibody and identified 3 antibody binding sites. The 3 antibodies of the present invention are completely different from those of the reported ZIKV antibody sequence, and are the 3 newly discovered antibodies. The binding constants of three antibodies and ZIKV E were 39.9pM (Z5), 44.7pM (Z6) and 200pM (Z7), three strains of human antibody showed strong Zika virus E protein binding capacity. Through competition experiments, three strains of antibody binding sites and 2A10G6 compete, three strains of antibody binding sites in the vicinity of FL, and virus, E protein in FL highly conserved. The antibodies of the invention are effective to detect common Flaviviridae viruses: Zika virus, dengue type 4 and 1 yellow fever virus infection, huge clinical detection and basic research applications.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种黄病毒人源单克隆抗体及应用，属于医药

技术介绍
2015年中南美洲暴发寨卡疫情，目前已经造成69个国家数百万人感染，我国也出现数例输入性病例。随着人口的流动及气候变化，寨卡病毒在我国存在较高的流行风险。然而，由于寨卡病毒感染时，80％患者无明显症状，20％患者症状轻微，不会引起患者重视。寨卡病毒(Zikavirus，ZIKV)属于黄病毒科，主要由蚊虫叮咬传播。同时，寨卡病毒可以通过母胎屏障，造成新生儿小头症。除此之外，寨卡病毒可以通过性传播。临床数据显示寨卡病毒既可以通过男性患者传染女性，也可以通女性患者传染男性。并且，研究表明男性精液中的寨卡病毒可存活62天，在他发病42天后仍能将寨卡病毒通过性接触传染给女性伴侣。越来越多的证据表明寨卡病毒感染的危害超出我们的认识：如引起新生儿小头症和神经症状(“格林-巴利综合征”等)。最近的研究揭示寨卡病毒感染雄性小鼠可造成睾丸损伤，并最终导致不育。因此必须要对寨卡病毒持续监控及检测，尤其对于育龄人群的检测更为重要。另外，为了研究寨卡病毒及其它黄病毒的致病机制、评估疫苗和治疗性药物效果等，动物模型，如小鼠模型的研究必不可少，这也迫切需要亲和力高，背景低的抗体用于实验研究。寨卡病毒是有囊膜的正链RNA病毒。囊膜上有E蛋白。E蛋白负责受体识别、结合及膜融合，含有重要的中和抗体表位。同时，E蛋白也是检测病毒的理想抗原。X-射线晶体学结构显示黄病毒E蛋白有三个结构域：DI，DII和DIII。DII头部(98-110位氨基酸)包含一个高度保守的融合区(fusionloop，FL)，在病毒入侵的膜融合过程中起关键作用。不同黄病毒FL区域保守性非常高，在病毒感染过程中，免疫细胞会产生大量的针对FL的抗体。已有研究发现有一些针对黄病毒的广谱抗体，如：2A10G6、4G2，这些抗体都是通过鼠杂交瘤融合产生的针对FL的抗体，其中2A10G6与E蛋白的亲和力KD＝2.7nM，4G2与E蛋白的亲和力未知，未见文献报道，因此在基础研究和临床检测中，可能存在亲和力较低，特异性不好，背景高的问题，一定程度上限制了抗体的使用及灵敏度。本专利技术的目的是鉴定高亲和力的人源抗体，用于基础研究和临床检测。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术以大肠杆菌表达的寨卡E蛋白作为抗原，从一例康复期寨卡患者的PBMCs中筛选到可以结合寨卡E蛋白的记忆B细胞。然后对筛选的单一B细胞进行RT-PCR，获得抗体的可变区序列与片段，并进一步与恒定区连接至表达载体中。经哺乳动物细胞表达、纯化后，检测与ZIKE-E蛋白的结合力。本专利技术获得了3株高亲力结合E蛋白的人源单克隆抗体。本专利技术的单克隆抗体，或抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列和/或轻链可变区的氨基酸序列，包含至少一个(比如三个)克隆Z5、克隆Z6或克隆克隆Z7的重链和/或轻链可变区的互补决定区(CDR)。本专利技术的第一个目的是提供一种抗体，或抗原结合片段，其包含(A)或(B)或(C)或(D)：(A)抗体的重链可变区含有SEQIDNO:1的26-35位，53-59位，和/或98-105位的氨基酸残基，且抗体的轻链可变区含有SEQIDNO:2的26-34位，52-54位，和/或91-100位的氨基酸残基；(B)抗体的重链可变区含有SEQIDNO:11的26-35位，53-59位，和/或98-107位氨基酸残基，及抗体的轻链可变区含有SEQIDNO:12的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸残基；(C)抗体的重链可变区含有SEQIDNO:21的26-35位，53-59位，和/或98-111位氨基酸残基，及抗体的轻链可变区含有SEQIDNO:22的26-33位，51-53位，和/或90-100位氨基酸残基；(D)在上述(A)、(B)、(C)中限定的位点处的氨基酸进行任何修饰或者替换而得到的抗体。其中，所述的抗体或抗原结合片段特异性结合ZIKE-E蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体或抗原结合片段，其重链可变区的氨基酸序列与SEQIDNO:1的序列具有至少90％的序列相似度且轻链可变区氨基酸序列与SEQIDNO:2的序列具有至少90％的序列相似度，或者其重链可变区的氨基酸序列与SEQIDNO:11的序列具有至少90％的序列相似度且轻链可变区氨基酸序列与SEQIDNO:21的序列具有至少90％的序列相似度，或者其重链可变区的氨基酸序列与SEQIDNO:31的序列具有至少90％的序列相似度且轻链可变区氨基酸序列与SEQIDNO:32的序列具有至少90％的序列相似度。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体或抗原结合片段，其重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:1且轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:2，或者其重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:11且轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:21，或者其重链可变区的氨基酸序列为SEQIDNO:31且轻链可变区氨基酸序列为SEQIDNO:32。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体命名为Z5；其重链可变区的核苷酸序列为SEQIDNO:3、轻链可变区的核苷酸序列为SEQIDNO:4。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体命名为Z6；其重链可变区的核苷酸序列为SEQIDNO:13、轻链可变区的核苷酸序列为SEQIDNO:14。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体命名为Z7；其重链可变区的核苷酸序列为SEQIDNO:23、轻链可变区的核苷酸序列为SEQIDNO:24。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体的重链，包括重链可变区和重链恒定区，其中重链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:31所示(核苷酸序列如SEQIDNO:32所示)。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体Z6的轻链为κ链，Z5和Z7的轻链为λ链；轻链包括轻链可变区和轻链恒定区；κ链的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:33所示(核苷酸序列如SEQIDNO:34所示)，λ链的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQIDNO:35所示(核苷酸序列如SEQIDNO:36所示)。本专利技术的三个抗体，来源于同一病患者，并且均靶向寨卡病毒特有的囊膜蛋白-E蛋白，通过结合E蛋白的DII区域的fusionloop与E蛋白高亲和力结合。本专利技术的第二个目的是提供编码所述抗体片段或者抗原结合片段的核苷酸序列、含有所述核苷酸序列的质粒、含有所述质粒的宿主细胞等。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述抗体的重链的序列，依次包括CMV启动子序列、EcoRI酶切位点序列、前导序列、编码重链可变区的序列、编码重链恒定区的序列、XhoI酶切位点序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体的轻链，为κ链和/或λ链；轻链包括轻链可变区和轻链恒定区。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述抗体的轻链的序列，依次包括CMV启动子序列、第一酶切位点序列、前导序列、编码轻链可变区的序列、编码轻链恒定区的序列、酶切位点序列XhoI。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体的轻链为κ链，第一酶切位点为SacI。在本专利技术的一种实施方式中，所述抗体的轻链为λ链，第一酶切位点为EcoRI。在本专利技术的一种实施方式中，所述前导序列的氨基酸序列如SEQIDNO:37所示(核苷酸序列如SEQIDNO:38所示)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，其包含(A)或(B)或(C)或(D)：(A)抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1的26‑35位，53‑59位，和/或98‑105位的氨基酸残基，且抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:2的26‑34位，52‑54位，和/或91‑100位的氨基酸残基；(B)抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:11的26‑35位，53‑59位，和/或98‑107位氨基酸残基，及抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:12的27‑32位，50‑52位，和/或89‑97位氨基酸残基；(C)抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:21的26‑35位，53‑59位，和/或98‑111位氨基酸残基，及抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:22的26‑33位，51‑53位，和/或90‑100位氨基酸残基；(D)在上述(A)、(B)、(C)中限定的位点处的氨基酸进行任何修饰或者替换而得到的抗体。

【技术特征摘要】
1.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，其包含(A)或(B)或(C)或(D)：(A)抗体的重链可变区含有SEQIDNO:1的26-35位，53-59位，和/或98-105位的氨基酸残基，且抗体的轻链可变区含有SEQIDNO:2的26-34位，52-54位，和/或91-100位的氨基酸残基；(B)抗体的重链可变区含有SEQIDNO:11的26-35位，53-59位，和/或98-107位氨基酸残基，及抗体的轻链可变区含有SEQIDNO:12的27-32位，50-52位，和/或89-97位氨基酸残基；(C)抗体的重链可变区含有SEQIDNO:21的26-35位，53-59位，和/或98-111位氨基酸残基，及抗体的轻链可变区含有SEQIDNO:22的26-33位，51-53位，和/或90-100位氨基酸残基；(D)在上述(A)、(B)、(C)中限定的位点处的氨基酸进行任何修饰或者替换而得到的抗体。2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段，其重链可变区的氨基酸序列与SEQIDNO:1的序列具有至少90％的序列相似度且轻链可变区氨基酸序列与SEQIDNO:2的序列具有至少90％的序列相似度，或者其重链可变区的氨基酸序列与SEQIDNO:11的序列具有至少90％的序列相似度且轻链可变区氨基酸序列与SEQIDNO:21的序列具有至少90％的序列相似度，或者其重链可变区的氨基酸序列与SEQIDNO:31的序列具有至少90％...

【专利技术属性】
技术研发人员：王奇慧，严景华，高福，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11