本发明专利技术属基因工程抗体技术领域，具体涉及一种抗人CD24抗体突变体的制备方法及用途。本发明专利技术利用基因工程技术将抗人CD24嵌合抗体的重链CH2区297位保守糖基化位点的天门冬酰胺突变为谷氨酰胺；哺乳动物真核表达体系稳定表达cG7Q；抗人CD24抗体突变体cG7Q基本保留了母体单抗cG7高亲和能力，能特异性结合于肿瘤细胞表面的CD24分子，且突变抗体的ADCC作用略有下降，有助于降低抗体及其偶联物的非特异性毒性；突变后的抗体暴露出相间的295位的谷氨酰胺，可以在谷氨酰胺转氨酶催化下借助含伯胺的linker将小分子毒性物质定点偶联到改突变抗体上，实现药物/抗体偶联比为4的抗体‑药物偶联物。
Design and application of an anti human CD24 antibody mutant
The invention belongs to the technical field of gene engineering antibody, in particular relates to a preparation method and an application of an anti human CD24 antibody mutant. The invention uses genetic engineering techniques, asparagine heavy chain CH2 chimeric antibody against human CD24 297 conserved glycosylation sites mutated to glutamine; mammalian eukaryotic expression system with stable expression of cG7Q; anti human CD24 antibody mutant cG7Q retained the maternal high affinity monoclonal antibody cG7, CD24 molecules can specifically bind to tumor the cell surface, and the effect of mutation of ADCC antibody decreased slightly, helps to reduce nonspecific cytotoxic antibodies and conjugates; antibody mutation after exposed and 295 glutamine, can be catalyzed by transglutaminase containing primary amine linker small molecule toxic substances to change the antibody coupling point mutation. The drug / antibody coupling ratio was 4 antibody drug conjugates.
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体涉及将本实验室通过杂交瘤技术自主筛选的鼠源抗人CD24单克隆抗体G7mAb(专利公开号：CN103819561A)进行嵌合改造以降低其免疫原性，进而以此嵌合抗体cG7为基础进行定点突变。这种新的在抗体恒定区CH2区297位保守糖基化位点具有突变的抗体突变体cG7Q，在暴露CH2区295位天然偶联位点谷氨酰胺的同时引入可用于抗体-药物定点偶联的额外两个谷氨酰胺位点，且单保持母体抗体的高亲和靶向作用和效应活性。
技术介绍
抗体药物偶联物(antibody-drugconjugate，ADC)由单克隆抗体和强效毒性药物(toxicdrug)通过生物活性连接器(linker)偶联而成，是一种靶向癌细胞的强效抗癌药物。由于其对靶点的准确识别性及非癌细胞不受影响性，极大地提高药效并减少毒副作用。近几年，全球已掀起抗体药物偶联物(ADC)的研发热潮。ADC类药物被认为能够更加高效和有效的治疗疾病，在未来将成为治疗疾病的重要手段。1.CD24研究表明白细胞分化抗原CD24(clusterofdifferentiation24)是一种潜在的致癌因子，在结直肠癌、乳腺癌、肝癌、小细胞肺癌等多种肿瘤组织中过表达，而在正常组织中低表达甚至不表达。基于CD24分子肿瘤细胞标记物的特点，我们提出CD24抗体作为有效的载体偶联小分子细胞毒性药物，靶向呈递毒性分子到肿瘤细胞，发挥抗肿瘤活性。科学家致力于该类型靶点设计抗体药物偶联物，这些肿瘤表面抗原均具有与CD24相同的特点：1.肿瘤细胞表面高表达；2.正常组织细胞表面不表达或低水平表达；3.具有一定的内吞能力。2.抗体-药物偶联物定点偶联当前，仅有2个ADC药物上市，约45个ADC药物处于临床开发。传统ADC药物是通过抗体表面天然的赖氨酸(Lys)残基或还原链间二硫键产生的半胱氨酸(Cys)的巯基将细胞毒素分子偶联到抗体表面，但是这两种方法都很难控制药物与抗体的偶联位置以及化学计量，因此制备的ADC药物都存在严重的产物异质性。鉴于传统的偶联方法制备的ADC存在严重的产物异质性这一缺陷，近年来研究人员采用基因工程的手段对抗体进行改造，从而实现药物定点、定量的偶联到抗体上，由此所得的ADC不仅具有均一的药物/抗体偶联比(drug/antibodyratio，DAR)，而且表现出极好的体内药动学性质，有效提高了细胞高毒性药物的治疗窗口，从而实现一些高毒性小分子发挥高效低毒的治疗效果。3.谷氨酰胺转移酶谷氨酰胺转移酶(transglutaminase，TG)可以识别并催化谷氨酰胺(Gln)的γ-酰胺基团与含有伯胺的化合物形成异肽链。来源于茂源链霉菌(Streptomycesmobaraensis)的细菌谷氨酰胺转移酶(BTGase)与哺乳动物来源的谷氨酰胺转移酶(transglutaminase，TG)相比，BTGase具有非Ca2+依赖性，高催化效率、低生产成本等优势。另一方面，BTGase对蛋白分子上的谷氨酰胺残基的选择性则比较特异，蛋白分子链的柔韧性以及谷氨酰胺临近氨基酸都对TGase催化的偶联有一定的影响作用。Farias等将抗M1S1抗体中HC和LC的C端分别插入LLQGA和GGLLQGA序列，并基于TG的催化作用与MMAE偶联，得到的ADC其平均DAR分别为1.9和1.8，单体率分别为99％和98.5％，但是所得ADC中约有1.3％的抗体在HC-Q295残基处形成了额外的偶联位点，原因可能是TG对底物的要求并不严格而将去糖基化的抗体上HC-Q295位点视作其底物，而正常抗体由于HC-N297位点会发生糖基化修饰而阻碍TG对附近HC-Q295位点的识别。天然的抗体由于糖基化的影响缺乏能够直接被BTGase识别催化修饰的位点，然而，当去除抗体的297位的保守的糖基化后，则会在重链恒定区暴露出可以被BTGase识别的谷氨酰胺Q295。基于上述理论基础与科研实践，本专利技术将本实验室通过杂交瘤技术自主筛选的鼠源抗人CD24单克隆抗体G7mAb(专利公开号：CN103819561A)进行嵌合改造以降低其免疫原性，进而以此嵌合抗体cG7为基础进行定点突变，将抗体cG7保守的糖基化位点N297位突变成谷氨酰胺(N297Q)，这样形成一个去糖基化的抗体，实现去糖基化的同时增加2个可进行定点偶联的谷氨酰胺位点，从而使cG7Q具有4个可被谷氨酰胺转移酶催化的偶联位点。这种突变抗体的设计开辟了一种新的定点偶联策略。该研究一方面在抗体的基础上进行特定氨基酸的突变，引入新的偶联位点，同时又利用了抗体天然的偶联位点，基本保留了抗体的天然结构，使其亲和力、抗原特异性结合能力和抗体效应都得到最大程度的保留；另一方面通过酶特异性催化，有效的将细胞毒性分子定点偶联到抗体上，降低了产物的异质性，在临床前研究与临床安全性评价中将会占据制高点。因此，具有自主知识产权的突变抗体cG7Q的开发，为肿瘤靶向治疗体系提供新颖的临床用药方案。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术针对传统抗体药物偶联技术的缺陷和不足，提供一种设计合理、使用方便的用于定点偶联细胞毒性分子的抗人CD24抗体突变体cG7Q。本专利技术抗体突变体的特征为将抗体重链297位保守的糖基化位点的天门冬酰胺突变为谷氨酰胺，使抗体每条重链上插入一个偶联位点，同时暴露出原始的糖基化位点附近的一个谷氨酰胺位点，利用微生物谷氨酰胺转移酶将连有药物的含伯胺的连接子偶联到抗体上，实现DAR为4的抗体定点偶联药物；同时保留了抗体原有的亲本活性。技术方案一种抗人CD24抗体突变体，该突变体以抗人CD24嵌合抗体cG7为基础，运用基因工程手段，构建成引入定点偶联位点的抗体突变体cG7Q，引入的位点为将重链CH2区297位的保守糖基化位点突变成的谷氨酰胺位点，其中所述的重链CH2区的297位的突变位点是指将氨基酸序列表SEQIDNO：2所叙述的180位的天门冬酰胺突变为谷氨酰胺。cG7Q完整结构的肽链由cG7重链可变区、突变的cG7重链恒定区和cG7轻链构成。一种哺乳动物细胞CHO-s分泌表达法，用于分泌表达抗人CD24抗体突变体cG7Q。一种分离的核酸分子，该核酸分子编码抗体突变体cG7Q。一种表达载体，含有抗人CD24抗体突变体cG7Q目的基因的核酸分子。一种重组宿主细胞，含有上述的表达载体。抗人CD24抗体突变体cG7Q的应用方式：将cG7的保守的糖基化位点297位天门冬酰胺突变成谷氨酰胺，通过谷氨酰胺转移酶(transglutaminase，TG)将毒素分子以一个可降解的含有伯胺的Amine-val-cit-PABC接头偶联到抗体CH2区天然的295位的谷氨酰胺以及突变的297位的谷氨酰胺位点上，制成具有靶向性的抗体偶联药物，其中，所述重链CH2区的295位谷氨酰胺是指氨基酸序列表中SEQIDNO：2所叙述的178位的谷氨酰胺。通过抗体靶向性，使毒素分子发挥更高药效的同时，减少对机体正常细胞的毒害作用，达到更好的治疗效果。专利技术进一步说明：本专利技术中将抗人CD24嵌合抗体cG7的297位保守的糖基化位点的天门冬酰胺突变成谷氨酰胺，后续可以通过谷氨酰胺转移酶将其与含有伯胺的linker-drug复合物进行特异性偶联而形成ADC。本专利技术的一个目的是构建抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗人CD24抗体突变体，具有以下特征：该突变抗体以抗人CD24嵌合抗体cG7为基础，运用基因重组等手段，构建成抗人CD24抗体突变体cG7Q。
【技术特征摘要】
1.一种抗人CD24抗体突变体，具有以下特征：该突变抗体以抗人CD24嵌合抗体cG7为基础，运用基因重组等手段，构建成抗人CD24抗体突变体cG7Q。2.根据权利要求1所述的一种抗人CD24抗体突变体，其特征在于：cG7Q的重链恒定区CH2区297位保守的糖基化位点天门冬酰胺突变为谷氨酰胺，其中所述的重链CH2区的297位的突变位点是指将氨基酸序列表中SEQIDNO：2所叙述的180位的天门冬氨酸突变为谷氨酰胺，突变后的抗体为去糖基化的抗体。3.一种哺乳动物细胞CHO-s分泌表达法，其特征在于：用于分泌表达权利要求1所述的抗人CD24抗体突变体。4....
【专利技术属性】
技术研发人员：马招兄，袁敏讷，徐瑶，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。