用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物及检测方法，序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。所述检测方法的内引物FIP和BIP终浓度为1.6μmol/L、外引物F3和B3终浓度为0.2μmol/L、环引物LF和LB终浓度为0.8μmol/L；反应温度为63℃。本发明专利技术在原来LAMP技术的基础上引入荧光染料，建立了荧光LAMP检测技术，由于使用仪器进行荧光收集，检测的灵敏度进一步提高，更加客观，操作更加简便，容易将方法标准化，易于推广使用。

Fluorescent LAMP primer for detecting vesicular stomatitis virus and detection method thereof

The invention discloses a method for detection of vesicular stomatitis virus primers and fluorescent LAMP detection method, sequence: SEQ NO:1, SEQ ID ID NO:2, SEQ NO:3, SEQ ID ID NO:4, SEQ NO:5, SEQ ID ID NO:6. The final concentration of the primer FIP and BIP in the detection method was 1.6 mol/L, the external primer F3 and B3 final concentration of was mol/L, and the final concentration of LF and LB was 0.8 mol/L, and the reaction temperature was about. The invention uses fluorescent dyes based on original LAMP technology, established a fluorescent LAMP detection technology, due to the use of instruments for fluorescence collection, to further improve the detection sensitivity, more objective, more convenient operation, easy standardization, easy to use.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于水疱性口炎病毒检测
，尤其涉及一种用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物及检测方法。
技术介绍
水疱性口炎病毒(VesicularStomatitisVirus，VSV)，具有新泽西型和印第安纳型两个抗原型，为人畜共患病。牛、马、猪为易感动物，双翅目昆虫(如蚊和白蛉)是主要虫媒。病畜的水疱液、水疱皮和淋巴结中病毒含量最多。其临床症状与口蹄疫、猪水疱病难以区分。近年来，针对VSV的研究已有多种实验室检测方法，如：病毒分离试验(VI)、血清中和试验(SN)、病毒中和试验(VN)、酶联免疫吸附试验(直接型、间接型、竞争型，ELISA)、逆转录聚合酶联合反应(RT-PCR)、实时荧光逆转录聚合酶联合反应(RealtimeRT-PCR)、免疫色层分析测试片(Lateralflowdevices,LFD)等方法在国际期刊上发表。根据世界动物卫生组织针对上述疾病在不同的适用对象中有不同的推荐检测方法，但纵观上述实验室检测方法，虽然具有各自的优点，但也有不同层面的不足或缺陷：VI检测周期长，不适用于快速鉴别诊断；ELISA法易出现假阳性，特异性不强；SN和VN法灵敏度不高；RT-PCR法需要后续的处理过程，步骤繁琐，耗时也较长，尤其是在检测几种病毒的时候，工作量仍然较大；RealtimeRT-PCR由于使用的荧光探针，其成本较普通PCR高；LFD法步骤繁琐，不适用于大规模的筛查。综上所述，现有的水疱性口炎病毒检测存在检测周期长，易出现假阳性，特异性不强，灵敏度不高，步骤繁琐。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物及检测方法，旨在解决现有的水疱性口炎病毒检测存在检测周期长，易出现假阳性，特异性不强，灵敏度不高，步骤繁琐的问题。本专利技术所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物的序列为：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6。本专利技术的另一目的在于提供一种所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物的合成方法，所述合成方法包括：根据GenBank数据库中水疱性口炎病毒的基因序列，选取其NP基因上的一段高度保守区作为扩增对象，使用分子生物学软件LAMPdesigner1.14设计荧光LAMP引物，采用HPLC方式进行纯化，并将合成后的引物用灭菌DEPC水稀释成100pmol/μL溶液，保存于-20℃。本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP检测方法，所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP检测方法包括以下步骤：步骤一，样品的核酸提取：按照核酸提取试剂盒Mag-BindViralDNA/RNAKit说明书提取样品核酸；步骤二，反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM12.5μL，40μmol/L的内引物FIP和BIP各1μL，20μmol/L的环引物LF和LB各1μL，5μmol/L的外引物F3和B3各1μL。，BstDNApolymerase0.8μL，逆转录酶0.2μL，病毒核酸2.0μL，补水至25.0μL。最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染；步骤三，仪器检测：在荧光PCR仪上反应条件调整为保温阶段63℃30s，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。进一步，所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP检测方法的内引物FIP和BIP浓度为1.6μmol/L、外引物F3和B3浓度为0.2μmol/L、环引物LF和LB浓度为0.8μmol/L，反应温度为63℃。本专利技术提供的用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物及其检测方法，由于LAMP反应针对靶序列6个区域设计所涉及，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，故其特异性极高；且DNA无需预先解链DNA，扩增速度快；环状引物的添加更使反应时间减半。本专利技术实施例提供的用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物，当其内引物(FIP和BIP)浓度为1.6μmol/L、外引物(F3和B3)浓度为0.2μmol/L、环引物(LF和LB)浓度为0.8μmol/L、反应温度为63℃时，扩增效果最佳。本专利技术在原来LAMP技术的基础上引入荧光染料，建立了荧光LAMP检测技术，由于使用仪器进行荧光收集，检测的灵敏度进一步提高，更加客观，操作更加简便，容易将方法标准化，易于推广使用。附图说明图1是本专利技术实施例提供的用于检测水疱性口炎病毒的检测方法流程图。图2是本专利技术实施例提供的水疱性口炎病毒荧光LAMP方法建立示意图。图3是本专利技术实施例提供的水疱性口炎病毒荧光LAMP特异性试验示意图。图4是本专利技术实施例提供的水疱性口炎病毒荧光LAMP灵敏度试验示意图。图5是本专利技术实施例提供的水疱性口炎病毒荧光LAMP检测稳定性试验1示意图。图6是本专利技术实施例提供的水疱性口炎病毒荧光LAMP检测稳定性试验2示意图。图7是本专利技术实施例提供的样品检测结果示意图。具体实施方式为更加明确地诠释本专利技术的目的、技术方案及优点，以下结合实施例，对本专利技术作详细描述。应当理解，此处所描述阐述的实施例仅用于解释本专利技术，不用于限定本专利技术。以下结合附图对本专利技术的应用原理作详细描述。本专利技术实施例提供的用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物为：SEQIDNO：1FIPTACCGCTGCAACTATCTTGGTGGCCTCGTTGAAGATGGATTSEQIDNO：2BIPATGAGCGTGCACCAATCAGATGCTAATGCTGCACAGTCTSEQIDNO：3F3TGGATGGTTTAGAGAATCAGTGSEQIDNO：4B3TCCACTGACCTTGCTTAGASEQIDNO：5LFCGGATCATTCTCCCATATGTCASEQIDNO：6LBCGGAACCATAGTCTCACGG如图1所示，本专利技术实施例提供的用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP检测方法包括以下步骤：S101：样品的核酸提取：按照核酸提取试剂盒Mag-BindViralDNA/RNAKit(200)说明书提取样品核酸；S102：反应管中成分配制：LAMP反应体系总体积为25μL，其中2×Taq反应液RM12.5μL，40μmol/L的内引物FIP和BIP各1μL，20μmol/L的环引物LF和LB各1μL，5μmol/L的外引物F3和B3各1μL，BstDNApolymerase0.8μL，逆转录酶0.2μL，病毒核酸2.0μL，补水至25.0μL。最后加20.0μL的封闭液以避免体系挥发和产物污染；S103：仪器检测：在荧光PCR仪上反应条件调整为保温阶段63℃30s，1个循环；循环阶段63℃15s，63℃45s，60个循环；于63℃45s处收集荧光信号，荧光通道选为FAM。本专利技术实施例提供的用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物的合成方法包括：根据GenBank数据库中水疱性口炎病毒的基因序列，选取其NP基因上的一段高度保守区作为扩增对象，使用分子生物学软件LAMPdesigner1.14设计实时荧光LAMP引物，由上海辉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物，其特征在于，所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物序列为：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物，其特征在于，所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物序列为：SEQIDNO：1、SEQIDNO：2、SEQIDNO：3、SEQIDNO：4、SEQIDNO：5、SEQIDNO：6。2.一种如权利要求1所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP引物的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括：根据GenBank数据库中水疱性口炎病毒的基因序列，选取其NP基因上的一段高度保守区作为扩增对象，使用分子生物学软件LAMPdesigner1.14设计实时荧光LAMP引物，采用HPLC方式进行纯化，并将合成后的引物用灭菌DEPC水稀释成100μmol/L溶液，保存于-20℃。3.一种利用权利要求1所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP检测方法，其特征在于，所述用于检测水疱性口炎病毒的荧光LAMP检测方法包括以下步骤：步骤一，样品的核酸提取：按照核酸提取试剂盒Mag-BindViralDNA/RNAKit说明书提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗宝正，薄清如，邵建宏，赵宇清，沙才华，廖秀云，陈轩，黄海超，
申请(专利权)人：珠海出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44