一种油菜遗传转化的方法技术

本发明专利技术公开了一种油菜遗传转化方法。该方法依次包括如下步骤：(1)将含有目的基因的重组表达载体导入农杆菌，得到重组农杆菌；(2)取重组农杆菌，对油菜的外植体进行侵染；(3)取所述外植体，置于共培养培养基，进行共培养；(4)取所述外植体，置于选择培养基，进行培养；(5)取所述外植体，置于分化培养基进行培养，获得分化芽；(6)取所述分化芽，置于生根培养基进行培养，获得转基因油菜。实验证明，采用本发明专利技术提供的方法进行油菜遗传转化，转化效率高(达12.0％‑12.5)，耗时短，为油菜转基因提供了强大的工具，具有非常重要的应用价值。

Method for genetic transformation of rape

The invention discloses a method for genetic transformation of rape. The method comprises the following steps: (1) containing target gene recombinant expression vector into Agrobacterium, recombinant Agrobacterium; (2) the recombinant Agrobacterium infected explants of Brassica napus; (3) the explants in the co culture medium, co culture; (4) the explants were cultured in selective medium; (5) the explants were cultured in differentiation medium, the differentiation of shoots obtained; (6) the differentiation of shoots on rooting culture medium to obtain transgenic rapeseed. Experiments show that the method provided by the invention of Rapeseed Genetic transformation, high conversion efficiency (up to 12% 12.5), short time, which provides a powerful tool for transgenic rapeseed, and has very important application value.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种油菜遗传转化的方法。
技术介绍
油菜是重要的油料作物。20世纪70年代前，油菜的遗传改良都是通过杂交、诱变等传统育种方法来实现的。自1985年首次利用根癌农杆菌介导法获得转基因甘蓝型油菜以来，油菜的转基因研究迅速发展，特别是近年来基因重组和转基因技术的出现，更是为油菜的遗传改良开辟了新的路径。然而，广泛栽培的油菜品种中还没有一种已建立较为理想的转化体系。油菜遗传转化效率低已经成为制约油菜功能基因组学研究和油菜转基因研究的瓶颈问题。目前常用的油菜品种是欧洲型油菜模式品种Westar，其获得转基因植株需要6-8周，转化效率约为0.8％。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供转化效率较高的油菜遗传转化方法。为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种油菜遗传转化方法。本专利技术所提供的油菜遗传转化方法，依次可包括如下步骤：(1)将含有目的基因的重组表达载体导入农杆菌，得到重组农杆菌；(2)取步骤(1)得到的重组农杆菌，对油菜的外植体进行侵染；(3)完成步骤(2)后，取所述外植体，置于共培养培养基，进行共培养；(4)完成步骤(3)后，取所述外植体，置于选择培养基，进行培养；(5)完成步骤(4)后，取所述外植体，置于分化培养基进行培养，获得分化芽；(6)完成步骤(5)后，取所述分化芽，置于生根培养基进行培养，获得转基因油菜。上述方法中，所述共培养培养基中含有1.0-1.5mg/L1-萘乙酸、4.0-6.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤和4.0-6.0mg/LAgNO3。所述选择培养基中含有0.8-1.2mg/L1-萘乙酸、2.0-4.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤和80-120mg/L头孢噻吩。所述分化培养基中含有0.1-0.3mg/L1-萘乙酸、1.0-3.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤、30-50mg/L卡那霉素和80-120mg/L头孢噻吩。所述生根培养基中含有80-120mg/L卡那霉素和80-120mg/L头孢噻吩。所述共培养培养基具体可为含有1.25mg/L1-萘乙酸、5.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤和5.0mg/LAgNO3的MS0培养基。所述选择培养基具体可为含有1.0mg/L1-萘乙酸、3.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤和100mg/L头孢噻吩的MS0培养基。所述分化培养基具体可为含有0.2mg/L1-萘乙酸、2.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤、40mg/L卡那霉素和100mg/L头孢噻吩的MS0培养基。所述生根培养基具体可为含有100mg/L卡那霉素和100mg/L头孢噻吩的MS0培养基。上述方法中，所述步骤(2)中，所述油菜的外植体可为所述油菜的子叶。上述方法中，所述油菜的子叶的获取方式可为：将无菌的油菜种子接种于培养基，光暗交替培养5-12d(如5d、7d或12d)，然后取子叶部分。所述培养基可为MS0培养基。所述子叶部分需尽量靠近生长点。上述方法中，所述步骤(2)中，所述“侵染”的步骤可如下：将所述油菜的子叶置于农杆菌侵染液中8-15min；所述农杆菌侵染液为将所述重组农杆菌悬浮于侵染培养基得到的。所述侵染培养基中含有80-120mg/L乙酰丁香酮。上述方法中，所述步骤(2)中，所述“侵染”的步骤具体可如下：将所述油菜的子叶置于农杆菌侵染液中10min；所述农杆菌侵染液为将所述重组农杆菌悬浮于侵染培养基得到的。所述侵染培养基具体可为含有100mg/L乙酰丁香酮的MS0培养基。上述方法中，所述农杆菌侵染液的OD600nm值可为0.15～0.25。所述农杆菌侵染液的OD600nm值具体可为0.20。上述方法中，所述步骤(3)中，所述共培养的条件为23-27℃、暗培养3-5天。所述步骤(4)中，所述培养的条件为23-27℃、光暗交替培养3-5天。所述步骤(5)中，所述培养的条件为23-27℃、光暗交替培养3-5周。所述步骤(6)中，所述培养的条件为23-27℃。上述方法中，所述步骤(3)中，所述共培养的条件具体可为25℃、暗培养4天。所述步骤(4)中，所述培养的条件具体可为25℃、光暗交替培养4天。所述步骤(5)中，所述培养的条件具体可为25℃、光暗交替培养4周。所述步骤(6)中，所述培养的条件具体可为25℃。上述方法中，所述光暗交替培养的周期具体可为14小时光照培养/10小时黑暗培养。所述光暗交替培养时的光照强度为13000-17000Lx。所述光暗交替培养时的光照强度具体可为15000Lx。上述任一所述的方法中，所述油菜具体可为油菜品种中双4号。上述任一所述“含有目的基因的重组表达载体”可为向载体pCAMBIA2301的多克隆位点插入目的基因，得到的重组质粒。上述任一所述目的基因具体可为编码鲑鱼降钙素的前体的核酸分子。所述编码鲑鱼降钙素的前体的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：b1)具有序列表中序列1自5′末端起第22至120位核苷酸所示的DNA分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第22至120位所示的DNA分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有85％或85％以上同一性，且编码鲑鱼降钙素的前体的DNA分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述鲑鱼降钙素的前体的DNA分子；所述鲑鱼降钙素的前体可为氨基酸序列如序列表中序列5自N末端起第158至190位所示的蛋白质。上述任一所述“含有目的基因的重组表达载体”可为含有表达盒的重组质粒。所述表达盒自上游至下游依次可包括如下元件：植物油体蛋白基因的启动子、融合基因和终止序列；所述融合基因中可含有区段甲和区段乙；所述区段甲编码植物油体蛋白；所述区段乙编码鲑鱼降钙素的前体；所述鲑鱼降钙素的前体可为氨基酸序列如序列表中序列5自N末端起第158至190位所示的蛋白质。所述融合基因中，5’末端为起始密码子，3’末端为终止密码子，中间为连续的编码区。所述鲑鱼降钙素的前体在植物体内可自发形成鲑鱼降钙素。所述区段乙可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：b1)具有序列表中序列1自5′末端起第22至120位核苷酸所示的DNA分子；b2)核苷酸序列是序列表中序列1自5′末端起第22至120位所示的DNA分子；b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有85％或85％以上同一性，且编码所述鲑鱼降钙素的前体的DNA分子；b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述鲑鱼降钙素的前体的DNA分子。所述融合基因还可包括一个以上区段丙；所述区段丙编码蛋白标签。所述蛋白标签具体可为6×His标签。所述融合基因还可包括区段丁；所述区段丁可为蛋白酶的酶切识别序列。所述蛋白酶可为满足如下条件的蛋白酶：所述蛋白酶对于所述融合基因的表达产物的酶切位置为特定氨基酸残基与其前一位氨基酸残基之间；所述特定氨基酸残基为所述鲑鱼降钙素的前体的第一个氨基酸残基。所述蛋白酶具体可为肠激酶。所述融合基因自上游至下游依次可包括如下区段：所述区段丙、所述区段甲、所述区段丁和所述区段乙。所述植物油体蛋白基因的启动子可为油菜油体蛋白(GenBank号为X94225.1)基因的启动子。所述油菜油体蛋白(GenBank号为X本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种油菜遗传转化方法，依次包括如下步骤：(1)将含有目的基因的重组表达载体导入农杆菌，得到重组农杆菌；(2)取步骤(1)得到的重组农杆菌，对油菜的外植体进行侵染；(3)完成步骤(2)后，取所述外植体，置于共培养培养基，进行共培养；(4)完成步骤(3)后，取所述外植体，置于选择培养基，进行培养；(5)完成步骤(4)后，取所述外植体，置于分化培养基进行培养，获得分化芽；(6)完成步骤(5)后，取所述分化芽，置于生根培养基进行培养，获得转基因油菜。

【技术特征摘要】
1.一种油菜遗传转化方法，依次包括如下步骤：(1)将含有目的基因的重组表达载体导入农杆菌，得到重组农杆菌；(2)取步骤(1)得到的重组农杆菌，对油菜的外植体进行侵染；(3)完成步骤(2)后，取所述外植体，置于共培养培养基，进行共培养；(4)完成步骤(3)后，取所述外植体，置于选择培养基，进行培养；(5)完成步骤(4)后，取所述外植体，置于分化培养基进行培养，获得分化芽；(6)完成步骤(5)后，取所述分化芽，置于生根培养基进行培养，获得转基因油菜。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述共培养培养基中含有1.0-1.5mg/L1-萘乙酸、4.0-6.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤和4.0-6.0mg/LAgNO3；所述选择培养基中含有0.8-1.2mg/L1-萘乙酸、2.0-4.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤和80-120mg/L头孢噻吩；所述分化培养基中含有0.1-0.3mg/L1-萘乙酸、1.0-3.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤、30-50mg/L卡那霉素和80-120mg/L头孢噻吩；所述生根培养基中含有80-120mg/L卡那霉素和80-120mg/L头孢噻吩。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中，所述油菜的外植体为油菜的子叶。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述油菜的子叶的获取方式为：将无菌的油菜种子接种于培养基，光暗交替培养5-12d，然后取子叶部分。5.如权利要求1至4...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘昱辉，李梅，贾士荣，王志兴，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11