一种基于银纳米探针的端粒酶活性比色检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于银纳米探针的端粒酶活性比色检测方法，包括银纳米粒子和修饰在银纳米粒子表面的平末端杂交双链，所述杂交双链由单链DNA和与所述单链DNA部分互补的核苷酸序列杂交而成，所述单链DNA由连续胞嘧啶链、间隔链和端粒酶结合底物链依次连接而成，所述核苷酸序列与端粒酶结合底物链完全互补，所述杂交双链通过连续胞嘧啶链修饰在银纳米粒子的表面。本发明专利技术制备的银纳米探针由于银纳米表面双链DNA的刚性结构和纳米粒子表面平端之间的堆叠作用，倾向于聚集并显示灰色，在端粒酶作用下，端粒酶结合底物链被延伸，由此在银纳米粒子表面形成了摇摆DNA末端，使银纳米粒子的稳定性增强，其倾向于分散态，并显示黄色。

Colorimetric assay for telomerase activity based on silver nano probe

The invention discloses a silver nano probe based on telomerase activity colorimetric detection method, including silver nanoparticles and modified on the flat end of hybrid silver nanoparticles surface double chain, the chain is composed of hybrid double stranded DNA and single stranded DNA part and the complementary nucleotide sequence hybridized, the single stranded DNA by continuous cytosine chain, chain spacer and telomerase substrate binding chain connected in sequence. The nucleotide sequence and telomerase substrate binding chain completely complementary, the hybrid double chain through continuous chain cytosine modified onto the surface of silver nanoparticles. The preparation of silver nano probe due to stacking interaction between silver nanoparticles surface of double stranded DNA rigid structure and flat end surface of nanoparticles, tend to gather and display gray, in telomerase under the action of telomerase substrate binding chain is extended, the swing end of DNA on the surface of silver nanoparticles into shape, to enhance the stability of silver nanoparticles and its tendency to disperse state, and display a yellow.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分析检测领域，具体涉及一种基于银纳米探针的端粒酶活性比色检测方法。
技术介绍
人端粒酶是由端粒酶RNA和端粒酶逆转录酶组成的核糖核蛋白，能够催化端粒重复序列(TTAGGG)n添加在端粒的3’端，补偿在细胞分裂过程中端粒的缩短。研究表明，端粒酶活性在大多数恶性肿瘤细胞中过度表达，是肿瘤细胞持续分裂乃至永生化的原因。作为人类肿瘤的最光谱标志物，端粒酶活性检测在癌症争端和治疗中极具吸引力。不同的技术，包括端粒重复序列扩增法(TRAP)、电化学方法、荧光法、表面等离子体共振、场效应晶体感应器、微阵列和扫描芯片，已被发展用于端粒酶活性的检测。与这些方法相比，比色法使得对复杂仪器的依赖最小化，可实现目视测定，将促进便携式、现场诊断和更易操控的检测方式。基于金纳米粒子的端粒酶活性比色分析方法已被建立。但是，根据粒子尺寸，金纳米粒子的摩尔消光系数仅有其同族元素的几分之一到几百分之一，极大地限制了检测灵敏度的提高。除金纳米粒子外，银纳米粒子也是重要的光学报告单元。银纳米粒子较之金纳米粒子的优势在于：(1)银纳米粒子比相同尺寸的金纳米粒子的摩尔消光系数更高，原则上灵敏度更高；(2)银的价格比金便宜50倍，有利于实现更加经济和易于推广的分析；(3)作为等离子体结构，银纳米粒子赋予了比色分析除吸收光谱之外的更多定量检测的选择。但是，银纳米粒子与如巯基和氨基等的传统固定基团之间的相互作用较弱，且在修饰条件下很容易被氧化。这些缺陷使得银纳米粒子难以被稳定地修饰生物分子，限制了其在检测中的应用范围。所报道的被分析物主要是掺杂在缓冲液或生物流体中的合成/外源性目标物。相比之下，对自有机体中内源性目标物的检测是风险评估和既定诊断的先决条件。
技术实现思路
为了解决上述现有技术中存在的不足，本专利技术的一个目的是提供一种用于检测端粒酶活性的银纳米探针，该银纳米探针在端粒酶的作用下，修饰在银纳米颗粒上的DNA的平末端被延长，产生短链DNA摇摆末端，其能增强银纳米粒子的稳定性，从而抵抗在DNA平末端条件下的聚集。本专利技术的第二个目的是提供上述银纳米探针的制备方法，通过银-胞嘧啶配位作用，多聚胞嘧啶被用作锚定序列，以迅速、有效的方式将DNA稳定地修饰在银纳米粒子上。本专利技术的第三个目的是提供上述银纳米探针在检测端粒酶活性中的应用。本专利技术的第四个目的是提供基于上述银纳米探针的端粒酶活性比色检测方法，制备得到的银纳米探针与端粒酶作用，产生对应的颜色，端粒酶的活性越大、数量越多，产生的颜色就越深，通过对不同浓度的端粒酶进行比色检测，作出标出曲线，根据标准曲线，即可确定对应的待检测的端粒酶的数量，试验发现，本专利技术制备的银纳米探针能够获得比金纳米探针类似物更高的灵敏度。为了解决以上技术问题，本专利技术的技术方案为：一种用于检测端粒酶活性的银纳米探针，包括银纳米粒子和修饰在银纳米粒子表面的若干条平末端杂交双链，所述杂交双链由单链DNA和与所述单链DNA部分互补的核苷酸序列杂交而成，所述单链DNA由连续胞嘧啶链、间隔链和端粒酶结合底物链依次连接而成，所述核苷酸序列与端粒酶结合底物链完全互补，所述杂交双链通过连续胞嘧啶链修饰在银纳米粒子的表面。平末端是指当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口是平整的，这样的切口叫平末端。其中的，端粒酶结合底物链是指与端粒酶结合底物完全互补的链，与另一条核苷酸序列互补，形成的具有DNA平末端的部分杂交双链结构。由于银纳米表面双链DNA的刚性结构和纳米粒子表面平端之间的堆叠作用，银纳米粒子的稳定性降低，倾向于聚集并显示灰色。但是，在端粒酶作用下，端粒酶结合底物链被延伸，产生单链端粒酶重复序列，由此在银纳米粒子表面形成了摇摆DNA末端。由于纳米粒子末端增强的柔性和增加的表面电荷数量，银纳米粒子的稳定性增强，其倾向于保持分散态，并显示黄色。端粒酶的活性越大、数量越多，黄色就越深，测得的吸光度就越大，所以，可以通过测定检测体系的吸光度确定端粒酶的活性。单链DNA中的连续胞嘧啶链可以与银纳米粒子进行配位结合，将杂交双链修饰在银纳米粒子的表面。端粒酶结合底物链位于末端，可以在端粒酶的作用下，生成单链端粒酶重复序列。间隔链可使得端粒酶底物区域自银纳米粒子表面隔开，增强与溶液相中端粒酶间的接触和作用几率。优选的，所述端粒酶结合底物链为AATCCGTCGAGCAGAGTT。优选的，每个银纳米粒子的表面修饰有12-16条平末端杂交双链优选的，连续胞嘧啶链中的胞嘧啶的数量为10-30个。优选的，所述间隔链为连续胸腺嘧啶间隔链Tn，其中n为连续胸腺嘧啶的数量，n为4-6，优选为5。上述银纳米探针的制备方法，包括如下步骤：一条由连续胞嘧啶链、间隔链和端粒酶结合底物链依次连接而成的短链DNA与另一条互补DNA预杂交，得到杂交双链，互补DNA与所述端粒酶结合底物链完全互补；所述杂交双链与银纳米粒子按设定比例混合，在混合液中加入缓冲液，培育后得到银纳米探针。优选的，所述预杂交时，将等摩尔的短链DNA与互补DNA混合后，在95-100℃退火8-15min，缓慢冷却后，即得。退火过程为DNA变性解离成单链的过程，在缓慢冷却过程中，互补的DNA单链会重新形成双螺旋结构，得到杂交双链。优选的，银纳米探针的培育方法，包括如下步骤：1)将杂交双链与银纳米粒子的混合液在室温条件下，搅拌1.5-2.5h；2)向混合液中加入柠檬酸缓冲液，使柠檬酸的最终浓度为3.5-4.5mM，培育25-35min；3)向混合液中继续加入柠檬酸缓冲液，使柠檬酸的最终浓度为7.5-8.5mM，培育25-35min；4)向混合液中加入磷酸盐缓冲液，使磷酸盐的最终浓度为20-22mM，培育55-65min，即得。每一步骤中的培育时间延长，使得DNA能够通过多聚胞嘧啶更稳定地修饰在银纳米粒子上。进一步优选的，上述培育方法还包括将制备得到的银纳米探针用Tris-HCl缓冲液洗涤的过程。更进一步优选的，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为8-12mM。该浓度的缓冲液可提供略偏碱性的pH值以利于银纳米探针的保存，同时相对较低的离子强度可避免银纳米探针自身发生聚集。上述银纳米探针在检测端粒酶活性中的应用。本专利技术中关于在端粒酶活性检测中的应用、检测端粒酶活性的方法既可以以疾病诊断或治疗为目的，也可以非疾病诊断或治疗为目的。一种用于端粒酶活性检测的试剂盒，包括上述银纳米探针、5×TRAP缓冲液、dNTPs溶液、BSA溶液和水。基于上述银纳米探针的端粒酶活性比色检测方法，包括如下步骤：将等体积、不同浓度的细胞裂解后，获得含有不同浓度端粒酶的细胞裂解液，将细胞裂解液与5×TRAP缓冲液、dNTPs溶液、BSA溶液、纯水以及上述银纳米探针混匀，培育后，检测650nm、395nm处的吸光度A650和A395，A650除以A395得到吸光度比值，构建吸光度比值与细胞浓度的线性方程；对待测样品，可通过测定样品的吸光度比值，带入线性方程，计算得到样品的细胞浓度。端粒酶活性与HeLa细胞浓度正相关，细胞浓度越高则端粒酶活性越大。dNTPs：核苷酸。BSA：牛血清白蛋白。优选的，所述细胞为HeLa细胞。优选的，所述培育的条件为：在30℃培育，培育时间为1h。在本专利技术的一个具体实施方式中，5×TR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测端粒酶活性的银纳米探针，其特征在于：包括银纳米粒子和修饰在银纳米粒子表面的平末端杂交双链，所述杂交双链由单链DNA和与所述单链DNA部分互补的核苷酸序列杂交而成，所述单链DNA由连续胞嘧啶链、间隔链和端粒酶结合底物链依次连接而成，所述核苷酸序列与端粒酶结合底物链完全互补，所述杂交双链通过连续胞嘧啶链修饰在银纳米粒子的表面。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测端粒酶活性的银纳米探针，其特征在于：包括银纳米粒子和修饰在银纳米粒子表面的平末端杂交双链，所述杂交双链由单链DNA和与所述单链DNA部分互补的核苷酸序列杂交而成，所述单链DNA由连续胞嘧啶链、间隔链和端粒酶结合底物链依次连接而成，所述核苷酸序列与端粒酶结合底物链完全互补，所述杂交双链通过连续胞嘧啶链修饰在银纳米粒子的表面。2.根据权利要求1所述的银纳米探针，其特征在于：连续胞嘧啶链中的胞嘧啶的数量为10-30个；或，所述间隔链为连续胸腺嘧啶间隔链Tn，其中n为连续胸腺嘧啶的个数，为4-6。3.权利要求1或2所述银纳米探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：一条由连续胞嘧啶链、间隔链和端粒酶结合底物链依次连接而成的短链DNA与另一条互补DNA预杂交，得到杂交双链，互补DNA与所述端粒酶结合底物链完全互补；所述杂交双链与银纳米粒子按设定比例混合，在混合液中加入缓冲液，培育后得到银纳米探针。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述预杂交时，将等摩尔的短链DNA与互补DNA混合后，在95-100℃退火8-15min，缓慢冷却后，即得。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：银纳米探针的培育方法，包括如下步骤：1)将杂交双链与银纳米粒子的混合液在室温条件下，搅拌1.5-2.5h；2)向混合液中加入柠檬酸缓冲液，使柠檬酸的最终浓度为3.5-4.5mM，培育25-35min；3)向混合液中继续加入柠檬酸缓冲液，使柠檬酸的最终...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜玮，王磊，徐晓文，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37