一种多维串联凝胶电泳系统、电泳方法及试剂盒技术方案

本发明专利技术属于蛋白凝胶电泳分离领域，具体涉及了一种多维串联凝胶电泳系统、电泳方法及试剂盒。所述多维串联凝胶电泳系统包括第一维TiO2‑聚丙烯酰胺复合凝胶电泳、第二维N‑羟乙基丙烯酰胺‑丙烯酰胺共聚凝胶电泳和第三维固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶电泳；其中，电泳凝胶是由TiO2‑聚丙烯酰胺复合凝胶、N‑羟乙基丙烯酰胺‑丙烯酰胺共聚凝胶、固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶和样品浓缩胶依次填充于电泳槽内制备所得。本发明专利技术所述多维串联凝胶电泳系统适用于碱性蛋白质混合物的分离，分离效果好，质量稳定；与下游质谱鉴定相容，干扰较小；适用于大规模蛋白质组的研究，特别适用于碱性组蛋白异构体的分离，便于质量控制和产业化。

Multidimensional series gel electrophoresis system, electrophoresis method and reagent kit

The invention belongs to the field of protein gel electrophoresis separation, in particular to a multidimensional serial gel electrophoresis system, an electrophoresis method and a reagent kit. The multidimensional system includes the first dimension gel electrophoresis tandem TiO2 polyacrylamide gel electrophoresis, the two-dimensional N composite hydroxyethyl acrylamide acrylamide gel electrophoresis and third immobilized Zr4+ polyacrylamide gel electrophoresis; gel electrophoresis which is composed of TiO2 poly acrylamide composite gel, N hydroxyethyl acrylamide acrylamide gel, immobilized Zr4+ polyacrylamide gel and sample concentration were filled in gel electrophoresis tank prepared. The series of multidimensional separation gel electrophoresis system suitable for alkaline protein mixture, the separation effect is good, the quality is stable; and identification of the downstream mass compatible, less interference; suitable for the research of large-scale proteomics, especially suitable for alkaline protein isomer separation, easy quality control and industrialization.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白凝胶电泳分离领域，具体涉及了一种多维串联凝胶电泳系统、电泳方法及试剂盒。
技术介绍
聚丙烯酰胺凝胶是电泳分离蛋白质的经典支持介质，聚合反应前，通过调节丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺单体的浓度比，形成具有不同程度交链结构、网孔大小和形状的高分子聚合物，施加直流电压后，具有不同分子量和电荷的蛋白质具有不同的泳动速度因而在聚丙烯酰胺凝胶上得以分离。现有的凝胶电泳技术中，通过等电点聚焦技术首先按照电荷进行第一维分离，再采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳按照蛋白质的质量差异进行第二维分离。常规等电点聚焦和聚丙烯胺酰胺凝胶电泳的缺点主要表现在六个方面：(1)等电点聚焦不适合于碱性或酸性蛋白，进行等电点聚焦需要价格昂贵的胶条和特殊仪器；(2)现有聚丙烯酰胺凝胶的结构单一，只有丙烯酰胺和N，N'甲叉双丙烯酰胺两种单体，因此制备的凝胶性质单一，仅仅只靠网孔大小和形状进行分离，不能满足分析复杂蛋白质混合物的需求；(3)不适合于碱性蛋白的分离，现有催化剂过硫酸铵APS和TEMED只能再碱性条件下引发聚合反应，而碱性蛋白在碱性条件下溶解度降低，容易产生沉淀。碱性蛋白质通常溶解于酸性溶液，但是APS和TEMED在酸性条件下发生质子化，降低了引发丙烯酰胺聚合反应的能力，导致聚合不完全、聚合时间长、制得的凝胶弹性差等缺点；(4)对具有相似结构和分子量的蛋白质分离能力差，特别不适合于组蛋白的分离；(5)对具有不同翻译后修饰的蛋白质异构体分离能力差。以碱性组蛋白为例，由于大量翻译后修饰的存在，其不同异构体的分子量非常相似，这使得常规聚丙烯酰胺凝胶电泳只能分离得到有限的几条蛋白质带；(6)常规聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后所使用的固定液和脱色液不适合于碱性蛋白，因为酸性的固定液和脱色液使碱性蛋白流失。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种用于分离碱性蛋白的多维串联凝胶电泳系统、电泳方法及试剂盒，实现对生物样品中碱性蛋白的分离和质谱鉴定。为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种用于分离碱性蛋白的多维串联凝胶电泳系统，包括：第一维TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶电泳、第二维N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶电泳和第三维固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶电泳；所述多维串联凝胶电泳系统的电泳凝胶是由TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶、N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶、固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶和样品浓缩胶依次填充于电泳槽内制备所得。上述方案中，所述TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶由如下方法制备得到，具体包括：(1)凝胶制备液的配制：将尿素、60％丙烯酰胺/0.4％N,N’-亚甲双丙烯酰胺、冰醋酸、蒸馏水以及10％(体积浓度)TritonX-100溶液混合均匀后，加入锐钛矿型纳米TiO2，漩涡混合均匀，使纳米颗粒均匀地分散在溶液中；(2)TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶的制备：将步骤(1)配制的凝胶制备液灌入凝胶槽两片玻璃之间的空隙中，使其高度为凝胶槽总高度的1/3，避免产生气泡；利用波长为365nm的紫外灯照射使聚合反应进行完全，待凝胶制备液凝固，得到用于第一维TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶电泳的TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶。上述方案中，所述N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶由如下方法制备得到，具体包括：(1)凝胶制备液的配制：将尿素、30％丙烯酰胺和30％N-羟乙基丙烯/0.4％N,N’-亚甲双丙烯酰胺、冰醋酸、蒸馏水以及10％TritonX-100溶液混合均匀后，加入锐钛矿型纳米TiO2，漩涡混合均匀，使纳米颗粒均匀地分散在溶液中；(2)N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶的制备：将步骤(1)配制的凝胶制备液灌入凝胶槽内、TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶之上，使其高度为凝胶槽总高度的1/3，避免产生气泡，利用波长为365nm的紫外灯照射使聚合反应进行完全，待凝胶制备液凝固，制得用于第二维N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶电泳的N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶。上述方案中，所述固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶由如下方法制备得到，具体包括：(1)螯合Zr4+的新型单体的制备：将腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐(ATPNa2)、烯丙基缩水甘油醚(AGE)加入到蒸馏水中，于40℃条件下搅拌3小时，得到能够螯合Zr4+的单体；(2)凝胶制备液的配制：将尿素、60％丙烯酰胺/0.4％N,N’-亚甲双丙烯酰胺、冰醋酸、蒸馏水以及10％TritonX-100溶液混合均匀后，加入ZrCl4溶液，漩涡混合均匀，再加入步骤(1)所得螯合Zr4+的新型单体，混合均匀后依次加入10wt％过硫酸铵和四甲基二乙胺；(3)固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶的制备：将步骤(2)配制的凝胶制备液灌入凝胶槽内、N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶之上，高度为凝胶槽总高度的1/6，避免产生气泡，待凝胶制备液凝固后，得到用于固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶电泳的固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶；上述方案中，所述样品浓缩胶由如下方法制备得到，具体包括：(1)凝胶制备液的配制：将尿素、60％丙烯酰胺/0.4％N,N’-亚甲双丙烯酰胺、冰醋酸、蒸馏水以及10wt％过硫酸铵和四甲基二乙胺，漩涡混合均匀；(2)样品浓缩凝胶的制备：将步骤(1)配制的凝胶制备液灌入凝胶槽内、固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶之上，使其淹没整个凝胶槽，小心插入干净的配套梳子，避免气泡的产生，待凝胶制备液充分凝固，取出梳子，得到样品浓缩凝胶。一种用于分离碱性蛋白的多维串联凝胶电泳分离方法，包括如下步骤：(1)配制样品缓冲溶液；配制辅助样品缓冲液；配制电泳液；(2)将待分析蛋白质溶解于样品缓冲溶液中得到待测样品液，所述待测样品液中待分析蛋白质的浓度为5μg/μL；再将辅助样品缓冲液与待测样品液按比例混合后得到混合液；(3)将所述电泳凝胶置于电泳槽内，加入电泳液，再将步骤(2)所得混合液加样到电泳凝胶的泳道内，施加直流电压，进行电泳分离；(4)电泳分离结束后，取出凝胶，进行CoomassieBlue染色、脱色；(5)将电泳分离所得蛋白胶条切下，用胰蛋白酶切，利用质谱分析并搜索蛋白质数据库，鉴定分离所得碱性蛋白。用于上述多维串联凝胶电泳分离方法的试剂盒，包括：(1)螯合Zr4+新型单体，其各组分的配比为：蒸馏水、腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐(ATPNa2)、烯丙基缩水甘油醚(AGE)的比值为20mL：1g：190μL；(2)TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶，其各组分配比为：尿素、60％丙烯酰胺/0.4％N,N’-亚甲双丙烯酰胺、冰醋酸、蒸馏水、10％(体积浓度)TritonX-100溶液和锐钛矿型纳米TiO2的比值为3.6g：2.5mL：500μL：3.73mL：370μL：10mg；(3)N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶，其各组分的配比为：尿素、30％丙烯酰胺和30％N-羟乙基丙烯/0.4％N,N’-亚甲双丙烯酰胺、冰醋酸、蒸馏水、10％(体积浓度)TritonX-100溶液和锐钛矿型纳米TiO2的比值为3.6g：2.5mL：500μL：3.73mL：370μL：10mg；(4)固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶，其各组分的配比为：尿素、60％丙烯酰胺/0.4％N,N’-亚甲双丙烯酰胺、冰醋酸、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分离碱性蛋白的多维串联凝胶电泳系统，其特征在于，包括：第一维TiO2‑聚丙烯酰胺复合凝胶电泳、第二维N‑羟乙基丙烯酰胺‑丙烯酰胺共聚凝胶电泳和第三维固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶电泳；所述多维串联凝胶电泳系统的电泳凝胶是由TiO2‑聚丙烯酰胺复合凝胶、N‑羟乙基丙烯酰胺‑丙烯酰胺共聚凝胶、固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶和样品浓缩胶依次填充于电泳槽内制备所得。

【技术特征摘要】
1.一种用于分离碱性蛋白的多维串联凝胶电泳系统，其特征在于，包括：第一维TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶电泳、第二维N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶电泳和第三维固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶电泳；所述多维串联凝胶电泳系统的电泳凝胶是由TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶、N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶、固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶和样品浓缩胶依次填充于电泳槽内制备所得。2.根据权利要求1所述的多维串联凝胶电泳系统，其特征在于，所述TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶由如下方法制备得到，具体包括如下步骤：（1）凝胶制备液的配制：将尿素、60%丙烯酰胺/0.4%N,N’-亚甲双丙烯酰胺、冰醋酸、蒸馏水以及10%TritonX-100溶液混合均匀后，加入锐钛矿型纳米TiO2，漩涡混合均匀，使纳米颗粒均匀地分散在溶液中；（2）TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶的制备：将步骤（1）配制的凝胶制备液灌入凝胶槽两片玻璃之间的空隙中，高度为凝胶槽总高度的1/3，避免产生气泡；利用波长为365nm的紫外灯照射使聚合反应进行完全，待凝胶制备液凝固，得到用于第一维TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶电泳的TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶。3.根据权利要求1所述的多维串联凝胶电泳系统，其特征在于，所述N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶由如下方法制备得到，具体包括如下步骤：（1）凝胶制备液的配制：将尿素、30%丙烯酰胺和30%N-羟乙基丙烯/0.4%N,N’-亚甲双丙烯酰胺、冰醋酸、蒸馏水以及10%TritonX-100溶液混合均匀后，加入锐钛矿型纳米TiO2，漩涡混合均匀，使纳米颗粒均匀地分散在溶液中；（2）N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶的制备：将步骤（1）配制的凝胶制备液灌入凝胶槽内、TiO2-聚丙烯酰胺复合凝胶之上，高度为凝胶槽总高度的1/3，避免产生气泡，利用波长为365nm的紫外灯照射使聚合反应进行完全，待凝胶制备液凝固，制得用于第二维N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶电泳的N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶。4.根据权利要求1所述的多维串联凝胶电泳系统，其特征在于，所述固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶由如下方法制备得到，具体包括步骤：（1）螯合Zr4+的新型单体的制备：将腺嘌呤核苷三磷酸二钠盐（ATPNa2）、烯丙基缩水甘油醚（AGE）加入到蒸馏水中，于40℃条件下搅拌3小时，得到能够螯合Zr4+的单体；（2）凝胶制备液的配制：将尿素、60%丙烯酰胺/0.4%N,N’-亚甲双丙烯酰胺、冰醋酸、蒸馏水以及10%TritonX-100溶液混合均匀后，加入ZrCl4溶液，漩涡混合均匀，再加入步骤（1）所得螯合Zr4+的新型单体，混合均匀后依次加入10wt%过硫酸铵和四甲基二乙胺；（3）固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶的制备：将步骤（2）配制的凝胶制备液灌入凝胶槽内、N-羟乙基丙烯酰胺-丙烯酰胺共聚凝胶之上，高度为凝胶槽总高度的1/6，避免产生气泡，待凝胶制备液凝固后，得到用于固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶电泳的固定化Zr4+聚丙烯酰胺凝胶。5.根据权利要求1所述的多维串联凝胶电泳系统，其特征在于，所述样品浓缩胶由如下方法制备得到，具体包括如下步骤：（1）凝胶制备液的配制：将尿素、60%丙烯酰胺/0.4%N,N’-亚甲双丙烯酰胺、冰醋酸、蒸馏水、10wt%过硫酸铵和四甲基二乙胺，漩涡混合均匀；（2）样品浓缩凝胶的制备：将步骤（1）...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟鸿英，张文洋，游萍萍，庞晨梦，
申请(专利权)人：华中师范大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42