人脐带间充质干细胞培养液及其培养方法技术

本发明专利技术公开了一种人脐带间充质干细胞培养液，包括体积比为4～6:100:0.8～1.2的浓缩血小板裂解液、伊斯科夫改良培养液和胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐补充液，4～6ng/mL胰蛋白酶抑制剂、12～18ng/mL重组人表皮生长因子和12～18ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。采用本发明专利技术的培养液对脐带组织进行贴壁培养；然后用TrypLE消化液消化；再传代培养。本发明专利技术得到的人脐带间充质干细胞纯度较高，可直接用于临床研究，且本发明专利技术的培养方法扩增效率高，取材方便，可避免道德争议。并且本发明专利技术所述的人脐带间充质干细胞的培养体系不含人血清及动物源性蛋白成份，大大降低了临床治疗时因引入外源蛋白而引起的不良反应，可直接应用于临床研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞培养
，具体涉及一种人脐带间充质干细胞培养液及其培养方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是来源于发育早期中胚层和外胚层的一类多能干细胞，最初在骨髓中发现。间充质干细胞在体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、软骨、骨、肌肉、肌腱、神经、肝、心肌、胰岛β细胞和内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能。脐带间充质干细胞来源主要有：1)骨髓来源：成人骨髓源间充质干细胞细胞数量及增殖分化潜能随年龄的增大而下降，病毒感染率较高，且供者间充质干细胞的采集须行骨髓穿刺术，来源受到限制。2)脐血来源：存在较多争议，且脐血间充质干细胞的分离会损失脐血中造血干祖细胞，影响脐血冻存。3)脐带来源：取材方便，来源广泛，对供者无不利影响，无道德伦理问题的限制，适应症范围广。间充质干细胞用于临床应用研究的种类主要是骨髓间充质干细胞和脐带间充质干细胞，这两类细胞都具有MSC共同的特点低免疫源性，特别是后者更为明显。脐带中组织结构简单，除了主要的大血管，其余均以结缔组织为主，造成了脐带间充质干细胞基本未与抗原接触，所以免疫源性很低。无论是骨髓间充质干细胞还是脐带间充质干细胞在目前的临床研究中异体移植时均不需要配型，受体也无明显的排异反应，这极大的增加了临床应用的可能性。但是，现有技术中人脐带间充质干细胞培养体系都含有人血清和/或动物源性蛋白，在临床治疗时易引入外源蛋白而引起不良反应。
技术实现思路
因此，本专利技术针对现有技术中人脐带间充质干细胞培养体系都含有人血清和/或动物源性蛋白，在临床治疗时易引入外源蛋白而引起不良反应的技术问题，目的在于提供一种新的人脐带间充质干细胞培养液。本专利技术的人脐带间充质干细胞培养液包括：体积比为4～6:0.8～1.2:100的浓缩血小板裂解液、胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐补充液(ITS，购自sigma，货号I3146)和作为基础培养基的伊斯科夫改良培养液(IMDM)，以及4～6ng/mL胰蛋白酶抑制剂、12～18ng/mL重组人表皮生长因子和12～18ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。本专利技术的培养液由于采用浓缩血小板裂解液代替牛血清蛋白并且无动物源性蛋白，可以很好地避免外源蛋白引起的不良反应，而且本专利技术的培养液培养得到的人脐带间充质干细胞纯度较高，可直接用于临床研究。在本专利技术一较佳实施例中，本专利技术的人脐带间充质干细胞培养液包括：体积比为5:1:100的浓缩血小板裂解液、胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐补充液和作为基础培养基的伊斯科夫改良培养液，以及5ng/mL胰蛋白酶抑制剂、15ng/mL重组人表皮生长因子和15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。伊斯科夫改良培养液即IMDM培养基里含有L-谷氨酰胺成份，不含α-硫代甘油、也不含有2-巯基乙醇；或者伊斯科夫改良培养液即IMDM培养基里也可以含有L-谷氨酰胺成份和酚红成份，不含α-硫代甘油、也不含有2-巯基乙醇，如ThermoFisher公司销售的IMDM培养基(货号为12440053)，具体的配方参见其官网(https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053)本专利技术的浓缩血小板裂解液可以根据下列方法制备得到：将血小板在20～24℃振荡保存1～5d，采用反复冻融法和超声法进行处理，离心、收集上清液、去除纤维蛋白并浓缩获得浓缩血小板裂解液，具体可参见文献：SofferE,OuhayounJP,DosquetC,etal.Effectsofplateletlysatesonselectbonecellfunctions.ClinOralImplantsRes.2004；15(5):581-588。本专利技术的另一目的在于提供一种人脐带间充质干细胞的培养方法，由该方法培养得到的人脐带间充质干细胞可符合临床治疗级别。本专利技术的技术方案概述如下：本专利技术的培养人脐带间充质干细胞的方法依次包括以下步骤：A)用本专利技术的人脐带间充质干细胞培养液对脐带组织进行贴壁培养；B)用TrypLE消化液消化；C)再本专利技术的人脐带间充质干细胞培养液传代培养。步骤A)所述的脐带组织为去除血管和内皮细胞并清洗干净的脐带碎块，可由下列方法制备得到：将人脐带剪成2～4cm优选2cm的脐带小段，再用75％酒精迅速冲洗3遍，在含有抗生素GA-1000(G表示庆大霉素，Gentamicin，浓度为30mg/mL；A表示两性霉素，Amphotericin，浓度为15μg/mL，1000表示使用时按照1:1000比例稀释使用)的无Ca2+和Mg2+的DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)中去除三根血管；然后用刮片刮2遍内层以去除单层内皮细胞，再用含有抗生素GA-1000的无Ca2+和Mg2+的DPBS洗3遍；最后将脐带小段剪成1～3mm3优选2mm3的脐带碎块。步骤A)中贴壁培养时，脐带组织在培养皿上的贴块密度为50％～70％优选60％，于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO2条件下，用本专利技术的人脐带间充质干细胞培养液对脐带组织进行原代培养6～10天优选8天得到初级原代培养物，原代培养期间每隔3～5天优选4天更换一次培养液。初级原代培养物继续用本专利技术的人脐带间充质干细胞培养液原代培养2～6天优选4天，细胞密度可达到80％，得到原代脐带间充质干细胞。步骤B)中，用例如10～20mL优选15mLTrypLE消化液于35～39℃优选37℃消化3～7分钟优选5分钟。步骤C)中，传代培养1～3代优选2代。其中传代培养前，先过滤TrypLE消化液，然后用2倍的本专利技术的人脐带间充质干细胞培养液稀释，再用本专利技术的人脐带间充质干细胞培养液按照1:3～7优选1:5比例传代培养得到大量的传代脐带间充质干细胞。所述方法还包括：步骤D)，用无动物源性蛋白且内含5％DMSO的CryoStoreCS5冻存液(购自Hemacare，货号205102)冻存传代脐带间充质干细胞；和/或，步骤E)，体外检测传代脐带间充质干细胞，所述体外检测例如包括体外功能性与免疫原性检测等，具体为人脐带间充质干细胞向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化，人类白细胞DR、DQ、DP抗原(HLA-DR,DQ,DP)检测；和/或，步骤F)，传代脐带间充质干细胞用于临床治疗。本专利技术的积极进步效果在于：本专利技术培养人脐带间充质干细胞的方法，可得到纯度较高的脐带间充质干细胞。一方面取材方便，所述脐带可取自足月胎儿，可避免道德争议；另一方面，与现有的培养方法相比，本专利技术所述的人脐带间充质干细胞培养体系不含人血清及动物源性蛋白成份，大大降低了临床治疗时因引入外源蛋白而引起的不良反应，可直接应用于临床研究。附图说明图1为人脐带间充质干细胞的显微镜照片；图2为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD73的流式细胞仪分析图；图3为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD90的流式细胞仪分析图；图4为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD105的流式细胞仪分析图；图5为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原CD166的流式细胞仪分析图；图6为实施例1培养得到的人脐带间充质干细胞表面抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人脐带间充质干细胞培养液，其包括：体积比为4～6:0.8～1.2:100的浓缩血小板裂解液、胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐补充液和作为基础培养基的伊斯科夫改良培养液，以及4～6ng/mL胰蛋白酶抑制剂、12～18ng/mL重组人表皮生长因子和12～18ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。

【技术特征摘要】
1.一种人脐带间充质干细胞培养液，其包括：体积比为4～6:0.8～1.2:100的浓缩血小板裂解液、胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐补充液和作为基础培养基的伊斯科夫改良培养液，以及4～6ng/mL胰蛋白酶抑制剂、12～18ng/mL重组人表皮生长因子和12～18ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。2.如权利要求1所述的人脐带间充质干细胞培养液，其特征在于包括：体积比为5:1:100的浓缩血小板裂解液、胰岛素转铁蛋白亚硒酸盐补充液和作为基础培养基的伊斯科夫改良培养液，以及5ng/mL胰蛋白酶抑制剂、15ng/mL重组人表皮生长因子和15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子。3.一种培养人脐带间充质干细胞的方法，其特征在于依次包括以下步骤：A)用权利要求1所述的人脐带间充质干细胞培养液对脐带组织进行贴壁培养；B)用消化液消化；C)再用权利要求1所述的人脐带间充质干细胞培养液传代培养。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A)所述的脐带组织为去除血管和内皮细胞并清洗干净的脐带碎块。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤A)中贴壁培养时，脐带组织在培养皿上的贴块密度为50％～70％优选60％，于35～39℃优选37℃、3～7％优选5％CO2条件下，用权利要求1所述的人脐带间充质干细胞培养液对脐带组织进行原...

【专利技术属性】
技术研发人员：高歌，杨帆，
申请(专利权)人：上海爱萨尔生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31