一种提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高草坪币斑病菌DNA提取质量的方法，包括如下步骤：培养皿中加入含有抗生素的MM培养基，在培养基表面铺上灭菌玻璃纸，挑取菌丝转移至培养基中间，25‑30℃黑暗条件培养7‑14d；刮取玻璃纸表面菌丝20‑50mg置于离心管中，通风干燥，往离心管中加入钢珠，液氮冷冻、磨碎菌丝；采用经典CTAB法提取得到基因组DNA，将基因组DNA溶解于TE缓冲液，静置24‑48h，离心，去除不溶于TE缓冲液的杂质。本发明专利技术通过使用MM培养基降低币斑病菌菌丝组织中的多糖含量，从而提高病原菌基因组DNA的提取质量，无需昂贵的仪器设备或DNA提取试剂盒，DNA提取质量显著提高、稳定性好且经济高效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物病原微生物领域，涉及一种提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法。
技术介绍
币斑病菌(SclerotiniahomoeocarpaF.T.Bennett)是草坪草上一种重要的植物病原真菌，它可以侵染几乎所有冷季型、暖季型草坪草以及其它部分禾本科植物。1932年，由该病菌侵染造成的币斑病首次在美国报道，目前币斑病菌已在世界范围内分布广泛。在我国，币斑病菌已出现在20多个省区多种草坪草上。币斑病主要有初夏和初秋两个发病高峰期，当土壤温度高于18℃、夜间湿度较大时币斑病开始发病，发病初期在草坪上形成约硬币大小的近圆形病斑，严重时，斑块可连接成大片的枯草区，严重影响草坪景观。币斑病菌菌丝生长旺盛，在适合的条件下，主要通过菌丝侵染的方式在寄主草坪草个体间迅速定殖并传播。现有技术中一般是采用PDA来培养币斑病菌，病原菌在培养基上培养时由于培养基给病原菌提供大量的糖，从而导致菌体中多糖含量较高，且不同菌株之间产多糖水平存在差异，而多糖含量高低直接影响基因组DNA提取效率。采用常规的DNA提取方法或市场上常用的试剂盒提取币斑病菌基因组DNA时，常因菌丝组织中大量的多糖存在，严重影响DNA的得率，而一些去除多糖的方法也很难把币斑病菌DNA提取过程中的多糖与目标DNA进行有效的分离。导致在进行后续的分子生物学相关实验，特别是在进行群体生物学或基因组学相关的研究时，常常因为很难获得稳定且较好质量的基因组DNA，而严重影响试验的进展。如何获取稳定、均一且高质量的币斑病菌基因组DNA成为很多进行币斑病菌相关研究人员面临的难题。因此开发一种提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法是进行相关研究的必要前提条件。
技术实现思路
本专利技术的目的是弥补现有技术的不足，提供一种提高币斑病菌DNA提取质量的方法。为了实现本专利技术的目的，本专利技术提供的技术方案如下：一种提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法，包括如下步骤：步骤(1)、菌丝培养：培养皿中加入含有抗生素的MM培养基，在培养基表面铺设灭菌玻璃纸，使用接种针挑取病原菌菌丝转移至培养基中间，25-30℃黑暗条件培养7-14d；步骤(2)、菌丝准备：使用灭菌解剖刀刮取玻璃纸表面菌丝20-50mg置于离心管中，置于通风处室温通风干燥12-18h，往离心管中加入钢珠，使用液氮冷冻、粉碎机磨碎菌丝用于DNA提取；步骤(3)、DNA提取：采用经典CTAB法提取得到基因组DNA，将基因组DNA溶解于TE缓冲液，静置24-48h，离心，去除不溶于TE缓冲液的杂质(包括蛋白、剩余多糖等)，使用1％琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测。作为本专利技术提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法的优选方案，还包括：ITS扩增：以基因组DNA为模板，采用通用引物对病原菌ITS区域进行扩增，使用1％琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳检测以检验基因组DNA提取效果。步骤(1)中，所述的含有抗生素的MM培养基的制备方法为：称取葡萄10g，K2HPO41.5g，KH2PO42g，(NH4)2SO41g，MgSO4·7H2O0.5g，酵母浸粉2g，琼脂粉15g，加入去离子水溶解并定容到1L，121℃湿热灭菌20min，待培养基温度降至55-60℃，加入氨苄青霉素、硫酸链霉素、四环素，使氨苄青霉素、硫酸链霉素、四环素的终浓度均为50mg/L。使用基本培养基(Minimummedium,MM)用于币斑病菌菌丝的培养，仅能满足币斑病菌基本生长需求，可达到降低菌丝中多糖含量的目的。培养皿中加入MM培养基的体积需严格控制，直径为6cm的培养皿加入MM培养基的体积2-3ml，直径为9cm的培养皿加入MM培养基的体积5-7ml，以正好可以覆盖培养皿底为准，培养基的厚度约为1-2mm，培养皿中培养基过厚时会提高菌丝中多糖含量而影响DNA得率。在25-30℃黑暗条件培养7-14d，在该培养温度下菌丝生长量可满足后续DNA提取要求，且DNA提取得率较高；培养时间越长DNA提取的得率越高，培养7-14天均可有效提出基因组DNA。步骤(2)中，用于DNA提取的菌丝质量20-50mg之间最佳，质量过高反而会影响DNA提取的得率；所述的通风处可以采用通风厨或者风扇，菌丝使用通风厨或风扇通风干燥，干燥时间以12-18h为宜，可使菌丝中的水分大大降低，有利于菌丝组织研磨的彻底。步骤(3)中，基因组DNA提取的具体方法为：按照质量体积比1-2.5mg：25μl，往病原菌菌丝中加入CTAB提取缓冲液，于65℃水浴30min，每隔10-15min混匀1次；加入与CTAB提取缓冲液等体积的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1(v/v/v)轻轻混匀，12000-13500rpm离心5-10min；取上清液于新的离心管中，加入0.6倍上清液体积的预冷异丙醇(4℃)，充分混合后室温(20～30℃)静置用于沉淀基因组DNA，12000-13500rpm离心1min后弃去上清液；沉淀用70％冷乙醇(4℃)洗涤1遍，65℃干燥5-10min后溶于TE缓冲液中，室温(20～30℃)静置24-48h，于-20℃保存。所述的CTAB提取缓冲液为：2％CTAB；100mmol/lTris-HCl，pH8.0；20mmol/lEDTA，pH8.0；1.4mol/lNaCl。所述的TE缓冲液为：10mmol/lTris-HCl，1mmol/lEDTA，pH8.0。本专利技术中20-50mg币斑病菌菌丝提取出的基因组DNA溶于100μlTE缓冲液中。所述的基因组DNA溶解于100μlTE缓冲液后，需室温静置24-48h以达到DNA充分溶解的目的，使用1％琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测前需要12000rpm离心1min以提高DNA的纯度。本专利技术所述的病原菌为草坪币斑病菌。本专利技术方法同样适用于提取其他高多糖含量的病原真菌的基因组DNA。和现有技术相比，本专利技术具有如下优点：本专利技术通过改变用于币斑病菌菌丝培养的培养基，以及控制病原菌菌丝培养条件及培养时间，同时结合常规的菌丝研磨和DNA提取方法，从而达到提高基因组DNA提取得率、质量及稳定性，降低DNA提取费用的目的。具体表现为：(1)本专利技术简单易行，无需借助专用的仪器设备或DNA提取试剂盒，无需特殊或昂贵的药品和试剂，常规分子生物学实验室就可完成，大大降低了成本。(2)本专利技术提取的币斑病菌基因组DNA无论在得率、质量还是稳定性方面均优于常规的币斑病菌DNA提取方法，大大提高了DNA提取成功效率。(3)本专利技术在对菌丝培养条件进行改进，通过降低菌丝中多糖含量以达到提高DNA提取质量，使后续借助PCR扩增的分子生物学相关实验过程更加流畅和容易，且这种方法改进不会增加额外的成本。(4)本专利技术所提供的通过改变培养基质降低菌丝多糖含量以提高DNA提取质量的思路具有应用于其它高多糖含量真菌基因组DNA提取中的潜力。附图说明图1为通过本专利技术方法获得的不同来源币斑病菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳示意图。1-7代表不同地理及寄主来源的币斑病菌。图2为通过常规方法获得的不同来源币斑病菌基因组DNA琼脂糖凝胶电泳示意图。1-7代表不同地理及寄主来源的币斑病菌。图3为在不同培养基体积及不同培养时间条件下同一来源币斑病菌基因组DNA提取效果比较。A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤(1)、菌丝培养：培养皿中加入含有抗生素的MM培养基，在培养基表面铺设灭菌玻璃纸，挑取病原菌菌丝转移至培养基中间，25‑30℃黑暗条件培养7‑14d；步骤(2)、菌丝准备：刮取玻璃纸表面菌丝20‑50mg置于离心管中，通风干燥12‑18h，往离心管中加入钢珠，使用液氮冷冻、粉碎机磨碎菌丝用于DNA提取；步骤(3)、DNA提取：采用经典CTAB法提取得到基因组DNA，将基因组DNA溶于TE缓冲液，静置24‑48h，离心，去除不溶于TE缓冲液的杂质。

【技术特征摘要】
1.一种提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法，其特征在于包括如下步骤：步骤(1)、菌丝培养：培养皿中加入含有抗生素的MM培养基，在培养基表面铺设灭菌玻璃纸，挑取病原菌菌丝转移至培养基中间，25-30℃黑暗条件培养7-14d；步骤(2)、菌丝准备：刮取玻璃纸表面菌丝20-50mg置于离心管中，通风干燥12-18h，往离心管中加入钢珠，使用液氮冷冻、粉碎机磨碎菌丝用于DNA提取；步骤(3)、DNA提取：采用经典CTAB法提取得到基因组DNA，将基因组DNA溶于TE缓冲液，静置24-48h，离心，去除不溶于TE缓冲液的杂质。2.根据权利要求1所述的提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法，其特征在于所述的含有抗生素的MM培养基的制备方法为：称取葡萄10g，K2HPO41.5g，KH2PO42g，(NH4)2SO41g，MgSO4·7H2O0.5g，酵母浸粉2g，琼脂粉15g，加入去离子水溶解并定容到1L，121℃湿热灭菌20min，待培养基温度降至55-60℃，加入氨苄青霉素、硫酸链霉素、四环素，使氨苄青霉素、硫酸链霉素、四环素的终浓度均为50mg/L。3.根据权利要求1所述的提高币斑病菌基因组DNA提取质量的方法，其特征在于培养皿中加入MM培养基的体积：直径为6cm的培养皿加入含有抗生素的MM培养基的体积2-3ml，直径为9cm的培养皿加入含有抗生素的MM培养基的体积...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡健，杨静雅，李婕，马子元，刘清源，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32