一种同时抵抗细胞衰老及恶性转化的人多能干细胞的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种同时抵抗细胞衰老及恶性转化的NRF2基因增强型的间充质干细胞的制备方法。本发明专利技术首次利用基因编辑技术成功改造抗逆相关基因，仅单一编码位点修饰便实现内源抗逆基因可控的主动激活，获得了抗逆特性提高的基因增强型间充质干细胞，并通过体内体外实验证明了基因增强型干细胞能够抵抗逆境及细胞衰老，具有更佳的组织修复功能以及抵抗恶性成瘤转化的能力。本发明专利技术的方法同时解决了细胞移植治疗中有效性与安全性两大关键和瓶颈性难题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种同时抵抗细胞衰老及恶性转化的人多能干细胞的制备方法。
技术介绍
细胞移植治疗是近年来再生医学领域最具前景和潜力的发展方向。细胞移植旨在补充或替代体内因疾病或衰老等因素导致的本已耗竭或失去正常功能的细胞，移植的细胞在体内存活并发挥正常功能，恢复组织内稳态，进而实现组织修复和再生。尽管细胞移植治疗已经在诸如骨髓干细胞移植治疗白血病等方面表达出极佳的治疗效果，但其更广泛的应用仍面临许多问题的挑战。目前，限制细胞移植治疗的主要因素集中在有效性和安全性两方面。细胞移植治疗的有效性主要体现在移植物移植前的质量及进入体内后能否存活整合并发挥再生功能。一方面，移植物在体外培养过程中存在一定的“寿命”，具体表现为持续受到复制压力影响，有限的连续传代后迅速进入细胞老化(cellularsenescence)状态，停止增殖且失去功能。另一方面，细胞移植的部位普遍位于疾病或衰老的组织微环境中，其中的炎性因子、有害代谢产物等会损害外源移植物。以上两方面都会导致细胞发生严重的功能性衰退，导致移植效率低下。细胞移植治疗的安全性主要集中在长期移植后的致瘤风险。细胞移植物在病体中持续受到压力胁迫，基因组可能变得极不稳定，若在癌基因或抑癌基因上发生突变，可能演变为癌症，形成安全隐患。如何通过特定的干预手段提高细胞移植治疗的效率，尽可能的降低致瘤风险一直以来都是再生医学能够广泛应用的决定性问题。然而，迄今为止尚未发展出简单有效的方法克服这一技术瓶颈。当前提高细胞移植效果的尝试主要集中在改善移植部位微环境和增强移植物“抗逆”特性两方面。许多研究通过在不利细胞发挥正常功能的病体微环境中补充外源“营养及保护因子”的方式来改善移植效果，但该方法仅能在短期内改善移植环境，移植复发等不良预后问题突出。与此相比，通过特定方法改善移植物的“内因”，即增强移植材料自身固有的抵抗逆境能力来实现移植效果的改善是更为直接和长效的手段。目前已有少数研究表明可以利用慢病毒或逆转录病毒载体导入抗逆相关蛋白，调控细胞内特定的信号通路或基因表达，增强细胞对逆境的抵抗，进而实现细胞移植治疗效果的提升。尽管一系列临床前研究证明了提高细胞固有抗逆特性的可行性，但整合型病毒载体介导的基因调控必然存在基因组的随机整合，基因突变风险加大，安全性堪忧，这大大削弱了其在临床上的应用价值。基因靶向编辑技术的发展极大的推动了细胞移植治疗的进步。这一技术使得人们可以精确的编辑基因组上的遗传密码，目前已有大量利用基因靶向编辑技术矫正疾病细胞致病突变的案例被报道。恢复正常功能的基因矫正细胞经体外扩增可以用于自体移植，是细胞移植治疗中绝佳的材料。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种同时抵抗细胞衰老及恶性转化的NRF2基因增强型的间充质干细胞的制备方法。本专利技术提供的间充质干细胞的制备方法包括如下步骤：(1)将离体的人多能干细胞中的NRF2蛋白的第82位的谷氨酸突变为甘氨酸，得到NRF2基因增强型的多能干细胞；(2)对所述NRF2基因增强型的多能干细胞进行定向诱导分化，获得NRF2基因增强型的间充质干细胞。上述方法中，步骤(1)中，所述将离体的人多能干细胞中的NRF2蛋白的第82位的谷氨酸突变为甘氨酸的方法为将NRF2基因的第245位的碱基A突变为碱基G；所述NRF2基因的第245位为NRF2基因编码区的第245位。上述方法中，所述将NRF2基因的第245位的碱基A突变为碱基G的方法为基因组定点编辑；所述基因组定点编辑的方法可为ZFN编辑、TALEN编辑、CRISPR/Cas9编辑或HdADV介导的定点编辑；所述基因组定点编辑的方法具体为HdADV介导的定点编辑。在本专利技术的实施例中，所述HdADV介导的定点编辑可通过如下方法实现：第一步、突变片段的获得将人类基因组NRF2基因第1和2号内含子(intron1-exon2-intron2)的基因片段中对应NRF2基因的cDNA序列的第245位的核苷酸位点，由野生型的碱基A突变为碱基G，且保持其他序列不变，得到突变后的片段；第二步、病毒表达质粒的构建将所述突变后的片段插入pCIHDAdGT8-4载体的AscI和SpeI酶切位点中，得到重组质粒。第三步、病毒表达质粒与辅助质粒共转染包装细胞获得重组腺病毒颗粒用PI-SceI(NEB)酶切所述重组质粒，得到线性化质粒，并将所述线性化质粒同辅助病毒AdHPBGF35共同导入包装细胞中进行重组腺病毒包装，得到重组腺病毒颗粒；所述包装细胞具体为人胚胎肾细胞293系的衍生细胞系116细胞；第四步、重组腺病毒颗粒感染目的细胞用重组腺病毒颗粒感染人多能干细胞，经过筛选，得到一个NRF2等位基因上位点正确编辑的细胞，将其记作NRF2AG/+hESC细胞；第五步、将所述线性化质粒和所述辅助病毒AdHPBGF35共同导入所述NRF2AG/+hESC细胞中再次进行基因编辑，并对编辑后细胞进行鉴定，获得两个NRF2等位基因上位点正确编辑的细胞，即为NRF2基因增强型的多能干细胞。上述方法中，步骤(2)中，所述定向诱导分化的方法包括如下步骤：(b1)将NRF2基因增强型的多能干细胞进行拟胚体分化，获得拟胚体；(b2)培养所述拟胚体至纤维状细胞出现；再经过传代培养，分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即为所述NRF2基因增强型的间充质干细胞。上述方法中，所述拟胚体分化的具体方法如下：准备含有300-500个细胞、大小均一的NRF2AG/AGhESC克隆，用室温PBS清洗一次，再用Dispase37℃消化20-30min。待ESC克隆形成球体后，用CDF12培养基重悬，然后加到低粘附培养板(Corning公司，货号3471)中，37℃，5％CO2条件培养1-3天后即形成拟胚体。培养所述拟胚体至纤维状细胞出现的具体方法如下：将所述拟胚体接种于基质胶包被的6孔板中进行培养，继续培养2周至纤维状细胞出现。上述方法中，所述人多能干细胞为人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞。上述方法中，所述人胚胎干细胞具体为人胚胎干细胞H9细胞系。本专利技术的另一个目的是提供利用上述方法制备获得的NRF2基因增强型的间充质干细胞。利用上述方法制备获得的NRF2基因增强型的多能干细胞也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还有一个目的是提供上述NRF2基因增强型的间充质干细胞或上述NRF2基因增强型的多能干细胞的新用途。本专利技术提供了上述NRF2基因增强型的间充质干细胞或上述NRF2基因增强型的多能干细胞在如下c1)-c5)中任一种中的应用：c1)制备抵抗和/或延缓细胞衰老的产品；c2)制备抵抗肿瘤发生的产品；c3)制备抵抗恶性成瘤转化的产品；c4)制备细胞移植治疗的产品；c5)制备再生和/或修复损伤血管的产品。本专利技术最后一个目的提供一种产品。本专利技术提供的产品的活性成分为上述NRF2基因增强型的间充质干细胞；所述产品的功能为如下m1)-m5)中任一种：m1)抵抗和/或延缓细胞衰老；m2)抵抗肿瘤发生；m3)抵抗恶性成瘤转化；m4)细胞移植治疗；m5)损伤血管的再生和/或修复。上述应用或上述产品中，所述抵抗和/或延缓细胞衰老体现在如下d1)-d6)中任一种：d1)在外源刺激物刺激下细胞活力增强；d2)在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：(1)将离体的人多能干细胞中的NRF2蛋白的第82位的谷氨酸突变为甘氨酸，得到NRF2基因增强型的多能干细胞；(2)对所述NRF2基因增强型的多能干细胞进行定向诱导分化，获得NRF2基因增强型的间充质干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种间充质干细胞的制备方法，包括如下步骤：(1)将离体的人多能干细胞中的NRF2蛋白的第82位的谷氨酸突变为甘氨酸，得到NRF2基因增强型的多能干细胞；(2)对所述NRF2基因增强型的多能干细胞进行定向诱导分化，获得NRF2基因增强型的间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中，所述将离体的人多能干细胞中的NRF2蛋白的第82位的谷氨酸突变为甘氨酸的方法为将NRF2基因的第245位的碱基A突变为碱基G。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述将NRF2基因的第245位的碱基A突变为碱基G的方法为基因组定点编辑；所述基因组定点编辑的方法可为ZFN编辑、TALEN编辑、CRISPR/Cas9编辑或HdADV介导的定点编辑；所述基因组定点编辑的方法具体为HdADV介导的定点编辑。4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述定向诱导分化的方法包括如下步骤：(b1)将NRF2基因增强型的多能干细胞进行拟胚体分化，获得拟胚体；(b2)培养所述拟胚体至纤维状细胞出现；再经过传代培养，分选其中CD73、CD90、CD105均为阳性的细胞类群，即为所述NRF2基因增强型的间充质干细胞。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述人多能干细胞为人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞；和/或，所述人胚胎干细胞具体为人胚胎干细胞H9细胞系。6.利用权利要求1-5中任一所述方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光慧，曲静，杨济平，铃木敬一郎，任若通，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11