产L‑色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物和使用其生产L‑色氨酸的方法技术

本发明专利技术涉及埃希氏杆菌属的微生物，其中通过灭活磷酸酶活性提高L‑色氨酸生产力。进一步，本发明专利技术涉及使用该埃希氏杆菌属的微生物生产L‑色氨酸的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及修饰的产L-色氨酸的埃希氏杆菌属(genusEscherichia)的微生物——其中磷酸酶的活性被灭活，和使用该埃希氏杆菌属的微生物生产L-色氨酸的方法。
技术介绍
L-色氨酸，是一种必需氨基酸，已经被广泛地用作饲料添加剂、药品比如输液剂等的基础材料、和保健功能食品等的基础材料。虽然这种L-色氨酸可以通过化学合成、酶反应、发酵方法等生产，但是目前L-色氨酸主要通过使用微生物的直接发酵生产。在早期阶段，开发产L-色氨酸菌株通过突变选择进行(韩国专利申请公布号1987-0001813)。连同遗传工程的开发一起，产色氨酸菌株的开发通过经由增强代谢过程中的酶合成——如增强色氨酸生物合成酶的表达——克服生物合成途径中酶的色氨酸反馈抑制的方法进行。但是，仍然需要开发具有高效生产力的用于工业用途的产色氨酸菌株。具体而言，已知参与通过微生物的色氨酸生物合成期间的最终反应阶段的色氨酸合酶(EC4.2.1.20)使用磷酸吡哆醛(PLP)作为辅酶。进一步，在丝氨酸被用作色氨酸合酶反应的底物的情况下，由serC编码的磷酸羟基苏氨酸转氨酶(EC2.6.1.52)使用PLP作为辅酶，并且因此，PLP被认为是色氨酸生物合成的重要辅酶。因此，预期维持适当的PLP浓度在相应酶的有效反应和期望产物的生物合成反应中起着重要作用。但是，除了色氨酸生产之外，辅酶还有助于多种反应，并且因此，适当地维持PLP水平的方法还没有被发现。此外，产色氨酸微生物中PLP水平的维持是否可以导致L-色氨酸生产力的增加还有待阐明。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术人已经进行了大量的努力来开发高效率地生产L-色氨酸的方法。他们灭活了由SEQIDNO：1的氨基酸序列表示的蛋白质的活性，所述氨基酸序列由目前为止功能尚不清楚的yigL基因编码，以便通过抑制为辅酶的PLP的分解来增加色氨酸生产能力，并且适当地维持细胞内PLP浓度。结果，他们确认了L-色氨酸生产能力被提高，因而完成了本专利技术。[技术方案]本专利技术的目标是提供产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物。本专利技术的另一目标是提供使用产L-色氨酸的微生物生产L-色氨酸的方法。[有益效果]本专利技术提供了修饰的产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物，其中由SEQIDNO:1的氨基酸序列表示的磷酸酶的活性被灭活。本专利技术示出了有效地和经济地生产L-色氨酸的效果，导致使用埃希氏杆菌属的微生物的更高产率。如上所述生产的L-色氨酸不仅可以被应用至动物饲料或饲料添加剂，而且还可以被应用至多种产品，比如人食品或其食品添加剂、药品等。[具体实施方式]为了实现上述目标，在一方面，提供了修饰的产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物，其中由SEQIDNO:1的氨基酸序列表示的磷酸酶的活性被灭活。例如，修饰的产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物可以是与未修饰的埃希氏杆菌属的微生物相比具有增加的色氨酸生产能力的微生物。如本文所使用的，术语“L-色氨酸”指的是α-氨基酸，是不在体内合成的必需氨基酸，并且是化学式为C11H12N2O2的芳香族L-氨基酸。为了增加微生物中的L-色氨酸生产能力，先前已经使用了包括增强产色氨酸途径中生物合成酶的表达和阻断侧链途径的方法。如本文所使用的，术语“磷酸酶”可以指的是催化用于从底物去除磷酸基团的蛋白质。在本专利技术中，“包括SEQIDNO：1的氨基酸的磷酸酶”是由yigL基因编码的蛋白质，预测其催化将底物PLP分解为吡哆醛和磷酸的反应。由于由yigL编码的蛋白质在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中被命名为磷酸吡哆醛磷酸酶(NCBI基因ID：12930615)但是在EcoCyc数据库(http://www.ecocyc.org)中被命名为磷酸糖(phosphosugar)磷酸酶，所以哪种功能是该蛋白质的主要功能还是未知的。根据当前研究，报道了yigL表达由热休克诱发(J.Gen.Appl.Microbiol.,(2005)V51,pp.93-103)并且存在公开以下的研究结果：yigL的翻译由sgrS——其是一类sRNA——激活，从而分解细胞内磷酸糖(J.Bacteriol.(2013)V195,pp.4804-4815)。但是，清楚的功能仍有待阐明。因此，除了由SEQIDNO：1表示的氨基酸序列之外，酶是与上述序列具有70％或更多、具体地80％或更多、更具体地90％或更多、甚至更具体地95％或更多、甚至仍更具体地98％或更多、和还甚至更具体地99％或更多的同源性的氨基酸，并且可以非限制性地包括酶，只要其具有与上述酶基本上相同或相应的效果。此外，在具有上述同源性并显示与酶相应效果的氨基酸序列的情况下，显而易见的是具有带有部分缺失、修饰、置换或添加的氨基酸序列的任何修饰的酶包括在本专利技术的范围内。可以非限制性地包括编码由SEQIDNO：1表示的磷酸酶的基因，只要其是可以编码该酶的序列和其可以指示为yigL基因。具体而言，除了由SEQIDNO：2表示的核苷酸序列之外，编码该酶的基因是与上述列举的序列具有80％或更多、具体地90％或更多、更具体地95％或更多、甚至更具体地98％或更多、和还甚至仍更具体地99％或更多的同源性的核苷酸序列。可以非限制性地包括基因序列，只要其编码具有与上述酶基本上相同或相应的效果的酶。此外，在具有上述同源性的核苷酸序列的情况下，显而易见的是具有部分缺失、修饰、置换或添加的核苷酸序列包括在本专利技术的范围内。如本文所使用，术语“同源性”指的是两个多核苷酸或多肽部分之间同一性的百分比。来自一部分与另一部分的序列之间的同源性可以通过本领域中已知的技术测定。例如，同源性可以通过使用容易获得并且能够排列(arrange)序列信息的计算机程序(例如：BLAST2.0)在两个多核苷酸分子或两个多肽分子之间直接地排列序列信息(即，参数，比如得分、同一性、相似性等)测定。除此之外，多核苷酸之间的同源性还可以通过下述进行测定：在用于在同源区域之间形成稳定双链的条件下杂交多核苷酸和利用单链特异性核酸酶解装配，然后测定解装配的片段的大小。如本文所使用的，术语“内源活性”指的是天然状态下或修饰之前微生物具有的酶的活性状态。术语“灭活”指的是其中与天然状态下或修饰之前的菌株相比编码酶的基因完全不表达的情况，和/或其中即使基因表达，酶具有降低的活性或无活性的情况。因此，相对于内源活性，灭活的活性指的是与天然状态下或修饰之前微生物最初具有的酶的活性相比，降低的活性或无活性。降低是宽泛的概念，其包括其中由于编码酶的基因的修饰等酶本身的活性低于微生物最初具有的酶的活性的情况；其中由于编码酶的基因的表达的抑制或翻译的抑制细胞内酶活性的总体水平低于天然状态下或修饰之前的菌株的总体水平的情况；和其组合。灭活酶活性的修饰方法可以通过应用本领域中熟知的多种方法实现。虽然不限于此，但是方法的实例可以包括用于将染色体上编码酶的基因替换为突变以降低其酶活性的基因的方法，包括其中酶活性被去除的情况；用于使编码酶的部分或全部基因缺失的方法；用于将编码酶的基因的表达控制序列替换为具有弱活性或无活性的序列的方法；用于在染色体上编码酶的基因的表达控制序列中引入修饰的方法；用于使染色体上编码酶的部分或全部基因缺失的方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰的产L‑色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物，其中包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列的磷酸酶的活性被灭活。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.14 KR 10-2015-00676601.一种修饰的产L-色氨酸的埃希氏杆菌属的微生物，其中包括SEQIDNO：1的氨基酸序列的磷酸酶的活性被灭活...

【专利技术属性】
技术研发人员：李锡明，李白硕，金径林，李光镐，李根喆，洪亨杓，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR