一种用于烟草花叶病毒定量检测的试剂盒和方法技术

本发明专利技术提供了一种烟草花叶病毒定量检测试剂盒及检测方法，属于植物病毒检测技术领域。本发明专利技术的烟草花叶病毒定量检测试剂盒包括如下分装试剂和酶标板：所述酶标板为烟草花叶病毒抗体预包被酶标板；所述分装试剂为：样品稀释液，为磷酸盐缓冲液；洗涤液，含质量分数为0.1～0.5％的Tween‑20的磷酸盐缓冲液；反应终止液，浓度为1.8～2.2mol/L的H2SO4溶液；酶标抗体工作液，辣根过氧化物酶标记的浓度为2μg/ml的特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体；显色剂；烟草花叶病毒标准品。本发明专利技术的试剂盒能够实现烟草花叶病毒的定量检测，且快速、准确度高、灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物病毒检测
，具体涉及一种用于烟草花叶病毒定量检测的试剂盒及检测方法。
技术介绍
烟草花叶病包括烟草普通花叶病和黄瓜花叶病，世界各烟区普遍发生。其中，我国南北烟区也有发生，尤其南方烟区受害较重。自苗期至收获期，烟区均能发病，且田间株发病率为5％～20％，个别田块可高达90％～100％。病叶在烤晒后颜色不均，烟味差，品质大为降低。烟区发病的损失可达50～70％，甚至失收。烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，烟草花叶病毒)，是一种单链RNA病毒，病毒粒体杆状，大小为300×18(nm)。体外保毒期为72～96小时。在无菌条件下致病力达数年，在干燥病组织内存活30年以上，是造成烟草花叶病的原因，对烟区的危害很大。目前常用的烟草花叶病毒的检测方法有直接观察法、电子显微镜检测法、生物学检测法、血清学检测法和分子生物学检测法等。但目前的检测方法存在准确性低、灵敏度低，检测时间长，对检测者有专业的技能要求，专业仪器昂贵等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种烟草花叶病毒定量检测试剂盒及检测方法，专利技术提供的试剂盒能够实现烟草花叶病毒的定量检测，且快速、准确度高、灵敏度高。本专利技术提供了一种烟草花叶病毒定量检测试剂盒，包括如下分装试剂和酶标板：所述酶标板为烟草花叶病毒抗体预包被酶标板；所述分装试剂为：样品稀释液，为磷酸盐缓冲液；洗涤液，含质量分数为0.1～0.5％的Tween-20的磷酸盐缓冲液；反应终止液，浓度为1.8～2.2mol/L的H2SO4溶液；酶标抗体工作液，辣根过氧化物酶标记的浓度为2μg/ml的特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体；显色剂；烟草花叶病毒标准品。所述烟草花叶病毒抗体预包被酶标板制备方法包括以下步骤：1)将特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体用包被缓冲液稀释至浓度为1.8～2.2μg/ml，加至酶标板，30～37℃反应2～5h或4～8℃静置过夜；2)用洗涤液对包被后的孔板进行洗涤；3)用封闭液对洗涤后的孔板进行封闭，30～37℃反应2～4h；4)对封闭后的孔板进行干燥，得到抗体预包被酶标板。优选的是，所述一次孵育和二次孵育的温度独立地选自22～26℃，所述一次孵育和二次孵育的时间独立地选自40～50min。优选的是，所述包被缓冲液为浓度为0.1mol/L，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液。优选的是，所述封闭液为含质量浓度1～2％BSA的碳酸盐缓冲液。优选的是，所述特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体的制备方法包括：用烟草花叶病毒重组蛋白免疫BALB/c小鼠后，进行细胞融合和克隆化筛选，得到单克隆抗体细胞株；将含有所述单克隆抗体细胞株的小鼠腹水纯化，得到特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体。优选的是，所述酶标抗体的制备方法包括：将辣根过氧化物酶水溶液与高碘酸钠水溶液混合，反应20～40min，得到辣根过氧化物酶预处理溶液；将抗体溶于偶联缓冲液，使抗体浓度为2～20mg/mL，透析过夜，得到抗体预处理溶液；将所述辣根过氧化物酶预处理溶液和抗体预处理溶液按照体积比为1：(0.5～2)混合，反应2h，得到酶-抗体偶联溶液；将硼氢化钠与酶-抗体偶联溶液混合进行封闭反应，得到酶-抗体封闭溶液；将酶-抗体封闭溶液在磷酸盐缓冲液中透析，得到酶标抗体工作液。优选的是，所述显色剂为TMB显色剂。本专利技术还提供了一种定量检测烟草花叶病毒的方法，包括以下步骤：从待检样本中提取蛋白，得蛋白提取液；用上述技术方案所述烟草花叶病毒定量检测试剂盒对所述蛋白提取液进行检测，所述检测过程包括加样、一次孵育、一次洗涤、加酶、二次孵育、二次洗涤、显色、终止和读数；根据得到的读数与以烟草花叶病毒蛋白标准品制作的浓度-吸光度标准曲线，得到待检样品中的烟草花叶病毒蛋白浓度。本专利技术提供了一种烟草花叶病毒定量检测试剂盒，包括包被缓冲液(碳酸盐缓冲液)封闭液、样品稀释液(磷酸盐缓冲液)、洗涤液(含质量分数为0.1～0.5％的Tween-20的磷酸盐缓冲液)、反应终止液(浓度为1.8～2.2mol/L的H2SO4溶液)、酶标抗体工作液(辣根过氧化物酶标记的浓度为2μg/ml的特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体)、显色剂和烟草花叶病毒标准品。试剂盒采用双抗体夹心ELISA方法检测样本中的TMV成分。在酶标板微孔条上预包被特异性针对TMV的单克隆抗体。当加入含TMV的样本后，微孔条上预包被的TMV抗体将其捕获，形成抗体-抗原复合物，酶标抗体与抗原抗体复合物结合，最终形成抗体-抗原-抗体-酶标抗体复合物，而后通过酶催化TMB底物试剂显色，终止后进行酶标仪读值。样本吸光度值与其所含TMV含量成正相关，与标准曲线比较，即可计算出样品中TMV的含量。使用本专利技术的方法检测植物中的烟草花叶病毒，加标回收率在95％～120％之间。本专利技术提供的病毒烟草花叶病毒的定量检测方法准确、可靠，与现有技术相比具有操作时间短，成本低的优势。附图说明图1为本专利技术实施例使用的标准品的拟合标准曲线。具体实施方式本专利技术提供了一种烟草花叶病毒定量检测试剂盒，包括如下分装试剂和酶标板：所述酶标板为烟草花叶病毒抗体预包被酶标板；所述分装试剂为：样品稀释液，为磷酸盐缓冲液；洗涤液，含质量分数为0.1～0.5％的Tween-20的磷酸盐缓冲液；反应终止液，浓度为1.8～2.2mol/L的H2SO4溶液；酶标抗体工作液，辣根过氧化物酶标记的浓度为2μg/ml的特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体；显色剂；烟草花叶病毒标准品。在本专利技术中，所述检测过程在抗体预包被酶标板中进行，所述抗体预包被酶标板的制备方法包括以下步骤：1)将特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体用包被缓冲液稀释至浓度为1.8～2.2μg/ml，加至酶标板，30～37℃反应2～5h或4～8℃静置过夜；2)用洗涤液对包被后的孔板进行洗涤；3)用封闭液对洗涤后的孔板进行封闭，30～37℃反应2～4h；4)对封闭后的孔板进行干燥，得到抗体预包被酶标板。在本专利技术中，所述一次孵育和二次孵育的温度独立地选自22～26℃，所述一次孵育和二次孵育的时间独立地选自40～50min。在本专利技术的抗体预包被酶标板的制备过程中，本专利技术优选将特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体用包被缓冲液稀释至浓度为2μg/ml，得到包被工作液，将包被工作液加置酶标板，优选每孔添加100～120μL；优选37℃反应3h或4℃静置过夜。在本专利技术中，所述包被缓冲液优选为浓度为0.1mol/L，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液。30～37℃反应2～5h或4～8℃静置过夜后，本专利技术优选用洗涤液对包被后的孔板进行洗涤，洗涤次数优选为2～4次，更优选为3次，每次洗涤时间优选为5～10min，更优选为6min。本专利技术优选对洗涤后的孔板进行封闭，每个孔加入封闭液的体积优选为120～160μL，更优选为150μL，封闭反应的温度优选为37℃，封闭时间优选为3h。在本专利技术中，所述封闭液优选为含质量浓度1～2％BSA的碳酸盐缓冲液，所述碳酸盐缓冲液优选为0.1mol/L，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液。封闭后，本专利技术优选对孔板进行干燥，所述干燥优选采用冷冻真空干燥，时间优选为2～5h，更优选为3h。得到干燥后的酶标板后，优选对酶标板进行真空热封。本专利技术对所述冷冻本文档来自技高网...

【技术保护点】
烟草花叶病毒定量检测试剂盒，其特征在于，包括如下分装试剂和酶标板：所述酶标板为烟草花叶病毒抗体预包被酶标板；所述分装试剂为：样品稀释液，为磷酸盐缓冲液；洗涤液，含质量分数为0.1～0.5％的Tween‑20的磷酸盐缓冲液；反应终止液，浓度为1.8～2.2mol/L的H2SO4溶液；酶标抗体工作液，辣根过氧化物酶标记的浓度为2μg/ml的特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体；显色剂；烟草花叶病毒标准品。

【技术特征摘要】
1.烟草花叶病毒定量检测试剂盒，其特征在于，包括如下分装试剂和酶标板：所述酶标板为烟草花叶病毒抗体预包被酶标板；所述分装试剂为：样品稀释液，为磷酸盐缓冲液；洗涤液，含质量分数为0.1～0.5％的Tween-20的磷酸盐缓冲液；反应终止液，浓度为1.8～2.2mol/L的H2SO4溶液；酶标抗体工作液，辣根过氧化物酶标记的浓度为2μg/ml的特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体；显色剂；烟草花叶病毒标准品。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述烟草花叶病毒抗体预包被酶标板制备方法包括以下步骤：1)将特异性鼠抗烟草花叶病毒单克隆抗体用包被缓冲液稀释至浓度为1.8～2.2μg/ml，加至酶标板，30～37℃反应2～5h或4～8℃静置过夜；2)用洗涤液对包被后的孔板进行洗涤；3)用封闭液对洗涤后的孔板进行封闭，30～37℃反应2～4h；4)对封闭后的孔板进行干燥，得到抗体预包被酶标板。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述一次孵育和二次孵育的温度独立地选自22～26℃，所述一次孵育和二次孵育的时间独立地选自40～50min。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述包被缓冲液为浓度为0.1mol/L，pH值为9.6的碳酸盐缓冲液。5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为含质量浓度1～2％BSA的碳酸盐缓冲液。6.根据权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：武爱波，徐伟，徐炜，孙陈莉，赵伟娟，朱婕，吴蔚，
申请(专利权)人：无锡福阳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32