MMPs、TIMPs在筛选用于诊断或治疗与心肌基质重构相关的疾病的药物中的用途制造技术

本发明专利技术公开了基质金属蛋白酶MMPs和基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMPs作为标志物在筛选用于诊断或治疗与心肌基质重构相关的疾病的药物中的用途，属于医学领域。本发明专利技术研究结果表明先天性心脏病组(CHD组)、风湿性心脏病组(PHD组)术前血液中的MMP‑3、MMP‑9、TIMP‑1含量均较冠心病组(COR组)高，MMP‑9增多更为显著；并且，CHD组、PHD组中MMP‑3、MMP‑9、TIMP‑1均较COR组分布广泛，CHD组、PHD组患者MMP‑1、MMP‑9、TIMP‑1的mRNA表达较COR组升高。因此，本发明专利技术揭示出MMP‑1、MMP‑9和TIMP‑1的动态平衡可作为心肌基质重构的重要标志，调节MMPs和TIMPs的活性有望成为心脏病治疗的新方向。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基质金属蛋白酶MMPs和基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMPs作为标志物在筛选用于诊断或治疗与心肌基质重构相关的疾病的药物中的用途，属于医学领域。
技术介绍
过去认为心脏重构只是由于心肌细胞内源性的变化，现在认识到心肌细胞外基质中胶原的数量、组成和结构的变化也参与了心脏重构，即基质组织修复再生的过程，并且是心室重构的重要原因，又称为心肌基质重构。心室重构是决定心脏病患者心功能及其预后的主要因素之一，是心脏基质成分合成或降解代谢失平衡的结果。心脏基质在维持心脏结构和功能完整性方面起着重要的作用。基质组织修复再生引起心肌纤维化和进行性心室扩张，最终导致心力衰竭。在心肌中存在的能降解所有心脏基质成分的基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMPs)，是重构过程中心脏基质降解的主要因素。在衰竭的心脏中，MMPs活性升高导致纤维胶原降解、细胞外基质重构，导致左室进行性扩张、收缩功能逐渐下降，MMPs在转录前和转录后水平都可被调节，而且可以通过底物间的相互作用和通过内源性生理抑制剂即基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissueinhibitorofmetalloproteinase,TIMps)来调节。因此MMPs、TIMPs及其调节因子间的相互作用决定了心肌纤维化过程的进展。调节心肌MMPs、TIMPs的表达和活性，成为控制心衰进展中心脏基质的组织修复和再生的重要治疗手段。因此，深入了解心肌基质的降解和重构对于明确基质金属蛋白酶及其抑制剂在重构中的机制非常重要。目前国内外对于心肌损伤后血管重建方面的研究比较深入，Hojo等对急性心肌梗塞中基质金属蛋白酶的表达进行了大量的研究，得出了急性心肌梗塞时很多基质金属蛋白酶是升高的。Creemers等对心衰进行研究时，发现一些金属蛋白酶抑制剂对于阻止心衰的进展、抑制心衰有很大帮助。这对SPinale等在前期对于心肌细胞蛋白分子以及基因表达方面的基础研究起着极大的继承和发扬。这就为我们现在的研究给予了巨大的提示。很多心脏疾病引起的心肌损伤、心脏手术，不可避免地使心肌受到了一定的损伤，虽然近年来心肌保护的研究取得了显著的效果，但是对于心肌损伤引起的各种并发症还是相对较多，检测手段还是相对单一，陈旧，繁杂，必须综合多方面检查和检验结果，而且最终的特异性并不是令人满意。目前对于MMPs和TIMPs的动态平衡在维持心肌细胞组织修复再生中的作用还缺乏前瞻性的研究，国内外对心肌损伤后引起的基质重构研究还处于初级阶段，因而对于新型检测手段、新型检测蛋白分子以及生物药物的研究势在必行。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过研究MMPs和TIMPs在先天性心脏病组(CHD组)、风湿性心脏病组(PHD组)、冠心病组(COR组)中的表达情况，从而揭示出MMP-1、MMP-9和TIMP-1的动态平衡可作为心肌基质重构的重要标志，从而揭示出基质金属蛋白酶MMPs和基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMps作为心衰标志物在筛选用于诊断或治疗心肌基质重构的药物中的用途，为心脏病治疗提供新的研究与治疗方向。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：基质金属蛋白酶MMPs和基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMPs作为标志物在筛选用于诊断或治疗与心肌基质重构相关的疾病的药物中的用途。作为对上述技术方案的进一步改进，所述MMPs为MMP-3和MMP-9。作为对上述技术方案的进一步改进，所述TIMPs为TIMP-1。作为对上述技术方案的进一步改进，MMP-3、MMP-9和TIMP-1的动态平衡与心肌基质重构有关。作为对上述技术方案的进一步改进，所述与心肌基质重构相关的疾病为心力衰竭。作为对上述技术方案的进一步改进，所述心力衰竭为由心肌基质重构造成的心肌肥大或增厚引发。本专利技术的有益效果在于：本专利技术通过了解心肌损伤以及手术后患者心肌基质重构情况，从MMPs和TIMps的动态平衡着手研究其对心肌基质的组织修复和再生作用，探寻影响心肌基质组织修复和再生的生物制剂和药物，为心肌损伤后基质重构造成的心肌肥大、增厚等引起的心力衰竭提供的有效的生物检测方法、新型检测蛋白、生物制剂以及药物治疗和预防。附图说明图1为MMP-3、MMP-9、TIMP-1在三组患者血中的含量对比图，CHD组与COR组比较，#P<0.05，HD组与COR组比较，*P<0.05；图2为MMP-3、MMP-9、TIMP-1的免疫组化形态分布图，其中A为CHD组、B为PHD组、C为COR组，1为MMP-3、2为MMP-9、3为TIMP-1。具体实施方式为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及附图对本专利技术作进一步说明。1.材料与方法1.1临床资料1.1.1研究对象及分组纳入2012年1月～2014年4月广州市红十字会医院行体外循环心脏手术的患者为研究对象。术前心功能分级(NYHA)Ⅱ～Ⅲ级、美国麻醉师协会分级(ASA)Ⅱ～Ⅲ级，术前均无风湿活动及冠心病史，术前1个月未使用激素及非甾体类抗炎镇痛药等。术前血红蛋白、凝血功能、电解质、肝、肾和肺功能均在正常范围，按照随机区组分组的方法根据进行的心脏手术不同，将研究对象分为3个组，第1组为先天性心脏病组(CHD组)；第2组为风湿性心脏病组(RHD组)；第3组为冠心病组(COR组)，且术前经超声心动图检查，未见房室的大小改变，设其为对照组。1.1.2标本采集与测定1.1.2.1标本采集(ELISA)分别于术前采血，(1)用含有EDTA的真空管对入选病人进行静脉采血4～5ml；(2)室温静置1h；(3)离心，3000r/min，15min；(4)在垂直超净台内，用移液器将上清液移至1.5ml离心管，及时盖上管盖，每个离心管移入lml血浆，吸取液体时切勿过猛，以免引起污染，最后可适当留下一层少量上清液，以保证血浆的纯度，离心管和枪头均经过高温灭菌处理；(5)贴上标签，-80℃保存。1.1.2.2标本采集(Rt-PCR)切除右心室内异常肌束，取约3mm×3mm心肌组织立即置于冻存管内，贴上标签，置于液氮速冻，-80℃冰箱保存，标本经伦理委员会审核并批准。1.1.2.3标本采集(免疫组化法)另取心肌组织，约2mm×2mm2与标签一起用纱布包好，大头针固定(固定大头针，避免损伤样本)。放入装有固定液的广口瓶中固定，常温保存。(所取心肌为右室异常肌束，经伦理委员会审核并批准)。1.2实验步骤1.2.1ELISA(1)确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目；(2)分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加BSA(2％)0.lml，余孔分别加标准溶液或待测样品0.lml，轻轻混匀，酶标板盖上锡箔纸，37℃，120min；(3)反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体，或甩去酶标板内液体，再对着吸水纸拍几下，洗涤2次；(4)将准备好的生物素抗体工作液按每孔0.lml依次加入，37℃反应60min；(5)PBS洗涤3次，每次浸泡1min左右，甩干；(6)将准备好的ABC(底物)工作液按每孔0.lml依次加入，37℃反应30min；(7)PBS洗涤5次，每次浸泡1～2min左右，甩干；(8)按每孔0.09ml依次加入己在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应，反应过程中，要本文档来自技高网...

【技术保护点】
基质金属蛋白酶MMPs和基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMPs作为标志物在筛选用于诊断或治疗与心肌基质重构相关的疾病的药物中的用途。

【技术特征摘要】
1.基质金属蛋白酶MMPs和基质金属蛋白酶组织抑制剂TIMPs作为标志物在筛选用于诊断或治疗与心肌基质重构相关的疾病的药物中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述MMPs为MMP-3和MMP-9。3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述TIMPs为TIMP-1。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴伟东，丁锋，易永盛，姜锋，罗磊，林苇嘉，
申请(专利权)人：广州市红十字会医院，
类型：发明
国别省市：广东;44