一种猪口蹄疫3ABC和2C抗体化学发光检测试剂盒，属免疫学检测领域，所述试剂盒包含化学发光免疫反应板、酶标抗体、血清稀释液、化学发光底物、化学发光增强剂和PBST洗涤液，其特征在于：所述化学发光免疫反应板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔板，每孔内底部联合包被3ABC和2C融合蛋白；所述酶标抗体为HRP‑兔抗猪lgG抗体；所述血清稀释液包含Tween‑20、牛血清白蛋白和大肠杆菌裂解液；所述化学发光底物为鲁米诺和牛血清白蛋白；所述化学发光增强剂含有IPP、H2O2和Tween‑20。本发明专利技术所述试剂盒，相对于只包被3ABC抗体的CLIA和市售常用的ELISA试剂盒相比，具有较高的敏感性、特异性和诊断能力，重复性与稳定性也较好。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学检测领域，具体地涉及一种猪口蹄疫3ABC和2C抗体化学发光检测试剂盒。
技术介绍
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、烈性传染病。口蹄疫病毒属于核糖核酸科，口蹄疫病毒属。它包括一个单链正义RNA，该RNA首先转录翻译成一个大的多聚蛋白，然后在蛋白酶的作用下被切割成四个结构蛋白（SP）（VP1、VP2、VP3、VP4）和10个非结构蛋白(NSP)（L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D、3AB、3ABC）。其中四个结构蛋白组成病毒的衣壳，而非结构蛋白对于口蹄疫病毒的复制是必不可少的。防控口蹄疫主要实施疫苗普遍免疫、扑杀、血清监测的形式。有效的血清监测对于防控口蹄疫的爆发至关重要。而区分疫苗免疫动物与口蹄疫感染动物（DIVA）对于监测口蹄疫是非常重要的。目前已经建立了许多关于口蹄疫的DIVA方法，例如病毒分离实验、病毒中和实验、实时定量PCR、分泌液IgAELISA和基于NSP的ELISA。其中NSPELISA由于具有高的敏感性和特异性而被普遍应用。市场上已经有许多检测3ABC、2C、3AB、2B等的商品化ELISA试剂盒，但这些ELISA方法敏感性与重复性差，常常不能满足临床检测的需求，尤其是对于那些已经免疫后的又感染口蹄疫病毒的动物。这些动物体内由于具有中和抗体使得口蹄疫病毒的复制很慢，导致体内具有很低浓度的非结构蛋白，因此用当前这种ELISA方法很难检测到。在各种非结构蛋白中，由于3ABC蛋白抗体具有很高的丰度以及它在体内较其它结构蛋白抗体持续时间长，而被目前普遍认为是最重要的感染口蹄疫的指标，但是3ABC抗体的产生时间和应答水平存在个体差异，已有研究表明，猪对口蹄疫病毒不如其他动物敏感，有时在接种口蹄疫病毒的猪机体内并不能检测到3ABC抗体或3ABC抗体产生的时间延迟，所以，以单独包被3ABC融合蛋白的试剂盒检测猪口蹄疫病毒，其结果会出现假阴性，准确性不高。2C蛋白是一个膜蛋白，它在纯化额灭活疫苗中是不存在的。此外，2C蛋白的抗体出现较早，被广泛用于检测口蹄疫的早期感染。由于动物感染口蹄疫后再不同时期会出现不同的非结构蛋白抗体，因此检测单一的非结构蛋白抗体是不准确的。所以对于诊断猪口蹄疫来说，至少应该检测一种以上的非结构蛋白。化学发光免疫分析技术（CLIA）是在放射性免疫和酶联免疫分析的基础上逐渐发展建立的。化学发光不需要背景荧光，所有的能量都来自于化学反应，因此消除了背景荧光，可以在很宽的线性范围内检测极低浓度的分析物。当前CLIA在人医诊断中已经较为普遍应用，例如检测艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、检测肿瘤标记物等等。当前关于猪口蹄疫诊断的化学发光免疫分析方法还未见报道。
技术实现思路
针对口蹄疫病毒检测所面临的问题，本专利技术拟提供一种猪口蹄疫3ABC和2C抗体化学发光检测试剂盒，该试剂盒相对于市场上常用的试剂盒产品，敏感性更高，特异性更强，诊断能力亦优于其他市售产品。一种猪口蹄疫3ABC和2C抗体化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包含化学发光免疫反应板、酶标抗体、血清稀释液、化学发光底物、化学发光增强剂和PBST洗涤液；所述化学发光免疫反应板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔板，每孔内底部联合包被3ABC和2C融合蛋白；所述3ABC和2C融合蛋白的联合包被过程为：将3ABC和2C融合蛋白加入到pH=9.6的碳酸盐缓冲液中，使3ABC和2C融合蛋白的浓度均为250ng/mL，30-37℃水浴15min；再加入柠檬酸铵，溶解，形成包被液，其中，包被液中柠檬酸铵的质量体积分数为20%；以100µL/孔的加样量将包被液加入到化学发光免疫反应板中，37℃孵育1h，再于4℃处理20-24h，甩掉化学发光免疫反应板中的包被液；再向每孔中加入200µL血清稀释液进行封闭，4℃静置20-24h；用PBST洗涤液洗涤2-3次，于37-50℃干燥1-2h，装袋封口，2-8℃保存；所述3ABC融合蛋白为重组蛋白，其中的3C蛋白上第46位组氨酸突变为酪氨酸和第163位半胱氨酸突变为甘氨酸；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪lgG抗体；所述血清稀释液为pH=7.2~7.4且浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液，其中包含体积分数为0.01%的Tween-20、质量体积百分数为1%的牛血清白蛋白和体积分数为1%的大肠杆菌裂解液；所述化学发光底物包含0.1mmol/L的鲁米诺和质量体积分数为0.1%的牛血清白蛋白，溶剂为0.05mol/L、pH=8.8的Tris缓冲液；所述化学发光增强剂含有0.07mmol/L的IPP、3mmol/L的H2O2和体积分数为0.002%的Tween-20，余量为水。进一步的，所述酶标抗体的制备是在交联剂过碘酸钠作用下，将辣根过氧化物酶连接在抗体上，再加入硼氢化钠进行还原稳定。进一步的，所述大肠杆菌裂解液是将未经转化的大肠杆菌Rosetta（DE3）培养至对数期，离心，得菌体沉淀；向菌体沉淀中加入与其等体积的50mmol/L的PBS缓冲液，混匀，得混合物Ⅰ；将混合物Ⅰ置于-80℃冰冻，再室温融解，反复冻融三次；将经反复冻融的混合物Ⅰ置于400W条件下超声破碎5s，重复5次，每次间隔5s，得混合物Ⅱ；将混合物Ⅱ进行离心，取上清，即为大肠杆菌裂解液。本专利技术所述的试剂盒检测猪口蹄疫3ABC和2C抗体的方法，包括以下步骤：将待检血清用血清稀释液稀释40倍后加入到化学发光免疫反应板中，同时设置标准阳性血清和标准阴性血清作为对照，将化学发光免疫反应板于37℃反应30min；用PBST洗涤液洗涤5次，加入用血清稀释液稀释40000倍的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪lgG抗体，37℃孵育30min；再经PBST洗涤液洗涤5次，加入化学发光底物和化学发光增强剂，5min后用化学发光免疫分析检测仪器检测发光值。进一步的，所述标准阳性血清是经口蹄疫病毒感染后60天的高感染滴度的猪血清；所述标准阴性血清是未免疫过任何疫苗的健康猪血清。有益效果1、本专利技术人利用原核表达系统，成功表达了全长3ABC蛋白和全长2C蛋白，并获得了两种高纯度的目的蛋白，其中的3ABC蛋白是利用基因定点突变技术，将其3C上特异的蛋白酶活性位点-第46位组氨酸（CAC）和第163位半胱氨酸（TGT）分别突变成了酪氨酸（TAC）和甘氨酸(GGT)；然后将该两种蛋白联合包被到反应板上，制备化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒能成功区分疫苗免疫的猪与口蹄疫感染的猪，实现了对口蹄疫高敏感、准确的检测，为猪口蹄疫的检疫与预防提供了条件。2、本专利技术所述融合蛋白的联合包被过程中，将两种蛋白同时加入到缓冲溶液中，在温和条件下达到分子间的平衡，防止因为分子竞争出现包被不均匀；同时考虑到两种蛋白同时存在于包被液中，单一蛋白纯度降低，物理吸附力减弱，所以在包被液中加入柠檬酸铵，柠檬酸离子上含有3个羧基，由于电子的离域效应，产生的极性位点与蛋白分子结合形成配位结构，减少蛋白分子的游离，使吸附在固相载体上的分子量增加；铵离子在碱溶液生成少量氨气，催化吸附的进行，从而提高吸附效率与双蛋白的平均化，提高化学发光免疫反应板的质量。3、本专利技术所述试剂盒利用本专利技术所述抗体的检测方法检测血清样品，当样品的阳性百分率（PP）>5.09%时，诊断的敏感本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪口蹄疫3ABC和2C抗体化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包含化学发光免疫反应板、酶标抗体、血清稀释液、化学发光底物、化学发光增强剂和PBST洗涤液，其特征在于：所述化学发光免疫反应板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔板，每孔内底部联合包被3ABC和2C融合蛋白；所述3ABC和2C融合蛋白的联合包被过程为：将3ABC和2C融合蛋白加入到pH=9.6的碳酸盐缓冲液中，使3ABC和2C融合蛋白的浓度均为250ng/mL，30‑37℃水浴15min；再加入柠檬酸铵，溶解，形成包被液，其中，包被液中柠檬酸铵的质量体积分数为20%；以100µL/孔的加样量将包被液加入到化学发光免疫反应板中，37℃孵育1h，再于4℃处理20‑24h，甩掉化学发光免疫反应板中的包被液；再向每孔中加入200µL血清稀释液进行封闭，4℃静置20‑24h；用PBST洗涤液洗涤2‑3次，于37‑50℃干燥1‑2h，装袋封口，2‑8℃保存；所述3ABC融合蛋白为重组蛋白，其中的3C蛋白上第46位组氨酸突变为酪氨酸和第163位半胱氨酸突变为甘氨酸；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪lgG抗体；所述血清稀释液为pH=7.2~7.4且浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液，其中包含体积分数为 0.01% 的Tween‑20、质量体积百分数为1%的牛血清白蛋白和体积分数为1%的大肠杆菌裂解液；所述化学发光底物包含0.1mmol/L 的鲁米诺和质量体积分数为0.1%的牛血清白蛋白，溶剂为0.05mol/L、pH=8.8的Tris缓冲液；所述化学发光增强剂含有0.07 mmol/L的IPP、3mmol/L的H2O2和体积分数为0.002%的Tween‑20，余量为水。...
【技术特征摘要】
1.一种猪口蹄疫3ABC和2C抗体化学发光检测试剂盒，所述检测试剂盒包含化学发光免疫反应板、酶标抗体、血清稀释液、化学发光底物、化学发光增强剂和PBST洗涤液，其特征在于：所述化学发光免疫反应板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔板，每孔内底部联合包被3ABC和2C融合蛋白；所述3ABC和2C融合蛋白的联合包被过程为：将3ABC和2C融合蛋白加入到pH=9.6的碳酸盐缓冲液中，使3ABC和2C融合蛋白的浓度均为250ng/mL，30-37℃水浴15min；再加入柠檬酸铵，溶解，形成包被液，其中，包被液中柠檬酸铵的质量体积分数为20%；以100µL/孔的加样量将包被液加入到化学发光免疫反应板中，37℃孵育1h，再于4℃处理20-24h，甩掉化学发光免疫反应板中的包被液；再向每孔中加入200µL血清稀释液进行封闭，4℃静置20-24h；用PBST洗涤液洗涤2-3次，于37-50℃干燥1-2h，装袋封口，2-8℃保存；所述3ABC融合蛋白为重组蛋白，其中的3C蛋白上第46位组氨酸突变为酪氨酸和第163位半胱氨酸突变为甘氨酸；所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标记的兔抗猪lgG抗体；所述血清稀释液为pH=7.2~7.4且浓度为10mmol/L的磷酸盐缓冲液，其中包含体积分数为0.01%的Tween-20、质量体积百分数为1%的牛血清白蛋白和体积分数为1%的大肠杆菌裂解液；所述化学发光底物包含0.1mmol/L的鲁米诺和质量体积分数为0.1%的牛血清白蛋白，溶剂为0.05mol/L、pH=8.8的Tris缓冲液；所述化学发光增强剂含有0.07mmol/L的IPP、...
【专利技术属性】
技术研发人员：常惠芸，刘泽众，邵军军，赵付荣，李秀梅，张永光，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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