本发明专利技术公开一株高葡萄糖耐受的寇氏隐甲藻驯化株、制备方法及应用。此高葡萄糖耐受的寇氏隐甲藻株是由购自美国菌株保藏中心ATCC，代码ATCC 30556的藻株作为出发株，本发明专利技术寇氏隐甲藻选用来自美国菌株保藏中心ATCC的(菌株代码ATCC 30556)为出发株；将初始寇氏隐甲藻ATCC 30556作为处理对象，在逐渐增补葡萄糖的by+培养基中进行多次驯化培养，每次所述驯化培养的处理对象为上一次驯化培养后藻株；驯化结束时葡萄糖浓度增加至54g/L；驯化过程共经历650天，共计130代；得到的高耐受葡萄糖的寇氏隐甲藻驯化株命名为ALE3。该寇氏隐甲藻的高葡萄糖驯化株在发酵生产的二十二碳六烯酸(DHA)时具有明显的经济优势和产业前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术公开一株高葡萄糖耐受的寇氏隐甲藻驯化株、制备方法及应用。属于生物
技术介绍
二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid，DHA)，属于ω-3类不饱和脂肪酸，是极为重要的一种具有高营养价值的脂肪酸，对婴儿大脑的正常发育、成人大脑功能的正常发挥有重要作用。传统上DHA是从深海鱼油中提取，但随着世界渔业资源的逐步减少，寻找DHA其他替代来源的努力也日益受到重视。其中，利用海洋微藻异养代谢发酵生产DHA已被视为一个主要的替代方法。寇氏隐甲藻有较好的DHA合成能力，DHA占细胞脂质的30％以上。寇氏隐甲藻(Crypthecodiniumcohnii)发酵生产DHA，与传统鱼油来源相比具有一系列优点，如发酵周期短，培养方式简单，微生物生长快，易于大规模培养；多不饱和脂肪酸含量高，产品质量稳定，氧化稳定性较好，不饱和脂肪酸成分单一，不含EPA或EPA含量低，易于分离纯化；同时克服了传统的从鱼油中获取DHA受原料、气候、产地、生产周期等诸多限制因素的影响。目前，葡萄糖是寇氏隐甲藻生产DHA的优质碳源，但是早期研究表明高浓度葡萄糖能够抑制隐甲藻生长及油脂积累。因此，隐甲藻藻株种质的改进对于促进隐甲藻生产DHA产业的可持续发展是十分重要的。早期研究表明，通过人为的将微生物置于特定的环境压力之下，经过一段时间的对微生物的定向驯化，可获得对该胁迫条件有较高抗性、适应性或利用能力的突变菌株。由于寇氏隐甲藻的全基因组及DHA的生物合成机制尚未明确，基因工程改造代谢途径难度较大。定向驯化的操作过程简单又可有效的改变菌种性能，从而获得感兴趣的表型。到目前为止，没有使用定向驯化获得高葡萄糖耐受的隐甲藻藻株的报道。本专利技术发现，通过定向驯化可获得高葡萄糖耐受的寇氏隐甲藻驯化株，与出发菌株相比，该驯化株耐受葡萄糖的能力明显提高，且油脂积累也有所增加。四个核心代谢标志物甘油、谷氨酸、丙二酸及琥珀酸出现上调，这和驯化株葡萄糖耐受性的提高有显著关联。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，获得一株高葡萄糖耐受的寇氏隐甲藻驯化株，并从葡萄糖耐受性、油脂积累及代谢物含量变化等方面分析驯化株的生长和代谢特征。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：选用来自美国菌株保藏中心ATCC的寇氏隐甲藻(菌株代码ATCC30556)为出发株。将所述初始寇氏隐甲藻培养于by+培养基，到36h可达到对数生长期中期，OD490可达到0.8；所述by+培养基的组成为：葡萄糖9g/L，酵母浸粉2g/L，海盐25g/L，pH为6.5。将所述初始寇氏隐甲藻培养于增补了高浓度葡萄糖的by+培养基中，生长速率会显著下降；所述的增补了葡萄糖的by+培养基中葡萄糖浓度呈依次递增的状态，酵母浸粉2g/L，海盐25g/L；当葡萄糖浓度高于25g/L时，所述初始寇氏隐甲藻到达对数生长期中期的时间可能延长至48～72h。将初始寇氏隐甲藻ATCC30556作为处理对象，在逐渐增补葡萄糖的by+培养基中进行多次驯化培养，每次所述驯化培养的处理对象为上一次驯化培养后藻株；驯化结束时葡萄糖浓度增加至54g/L；驯化过程共经历650天，共计130代；得到的高耐受葡萄糖的寇氏隐甲藻驯化株命名为ALE3。具体过程如下：所述驯化过程中，初始寇氏隐甲藻培养于250mL的锥形瓶中，瓶中装有50mL的增补了葡萄糖的by+培养基；控制初始接种OD490为0.08，当隐甲藻藻液的OD490达到或超过0.8之后进行传代。所述驯化过程中，驯化株生长36h后OD490可达到或超过0.8时，提高葡萄糖浓度。所述驯化过程中，培养基中的葡萄糖浓度呈依次递增的状态；葡萄糖浓度高于18g/L时，以4g/L的增幅逐渐增加葡萄糖的浓度，葡萄糖浓度高于36g/L时，葡萄糖浓度增幅改为2g/L。所述驯化过程中，每隔一段时间会取细胞样品并用奥林巴斯BX43荧光显微镜观察驯化株的形态，同时并结合涂平板的方法检测等方法排除生物污染现象。所述驯化过程中，驯化株传至130代，细胞出现结块现象，驯化结束。此时葡萄糖浓度已提高至54g/L。所述驯化过程共历经650天。由所述驯化过程获得的驯化株命名为ALE3。将所述驯化株ALE3分别培养于增补了葡萄糖的by+培养基中，葡萄糖浓度为9g/L，36g/L，45g/L和54g/L。使用葡萄糖氧化酶发测定培养基中残糖浓度，使用BD公司FACSCalibur流式细胞仪和油脂提取方法测定油脂含量，使用安捷伦7890A/5975C气质联用仪测定培养物DHA含量，使用统计学t检验分析驯化株ALE3与出发藻株之间的显著性差异，同时从平行培养物中提取细胞代谢物，利用代谢组学方法检测分析胞内代谢物的变化情况。将所得的代谢组数据进行加权关联网络分析(WGCNA)，通过模块检测找出与驯化株相关的模块(每种模块用一种颜色表示)；然后筛选出显著相关的置信模块；最后分别对每种显著相关的置信模块建构代谢网络拓扑结构图，找出核心化合物。在WGCNA建构中，若一个化合物与超过5个化合物均有连接，则认为这个化合物为核心代谢标志物。经过分析，得到的高葡萄糖耐受的寇氏隐甲藻驯化株，其特征在于：(1)在36、45及54g/L高葡萄糖浓度培养基中培养，相对于出发株，比生长速率分别提高了1.03、2.78及3.52倍，平均倍增时间分别缩短了23.5％、31.9％及6.4％，同时葡萄糖消耗速率分别提高了2.67、2.62及2.51倍；(2)25℃下培养72h后，提取油脂，相对于出发株，油脂积累分别增加了6.8％、14.2％及16.3％，同时，使用尼罗红染色及流式细胞仪分析，细胞内部复杂程度有所增加；(3)通过GC-MS的代谢组学方法及WGCNA方法，检测并分析胞内代谢物的含量变化情况，相对于出发株，21个化合物明显上调，且分别位于和藻株正相关的蓝色、绿色两个模块中；其中蓝色模块鉴定出甘油、谷氨酸、丙二酸及琥珀酸四个核心代谢标志物。所述的核心代谢标注物已经证明和抗胁迫有关，如甘油、谷氨酸，但它们和隐甲藻葡萄糖耐受性提高相关联首次被发现。本专利技术与已有技术相比有以下显著特点和积极效果：通过定向驯化有效获得一株高葡萄糖耐受的寇氏隐甲藻。此驯化株不仅能耐受高浓度葡萄糖，且油脂积累也有明显增加，同时公开了与驯化株葡萄糖耐受提高相关的代谢标志物。附图说明图1为寇氏隐甲藻ATCC30556的驯化时间图示。图2为9g/L葡萄糖浓度下寇氏隐甲藻原始出发藻株与驯化株的生长及葡萄糖消耗对比图。图3为36g/L葡萄糖浓度下寇氏隐甲藻原始出发藻株与驯化株的生长及葡萄糖消耗对比图。图4为45g/L葡萄糖浓度下寇氏隐甲藻原始出发藻株与驯化株的生长及葡萄糖消耗对比图。图5为54g/L葡萄糖浓度下寇氏隐甲藻原始出发藻株与驯化株的生长及葡萄糖消耗对比图。图6为寇氏隐甲藻原始出发藻株与驯化株的油脂积累及DHA相对含量对比图。统计学分析p值小于0.05表明出发藻株与驯化藻株之间存在显著性差异(*p<0.05)，p值越小，差异越大。图7为不同葡萄糖浓度下寇氏隐甲藻原始出发藻株与驯化株的流式细胞仪比较分析。图中蓝色散点表示出发株，红色散点表示驯化株。图中红色散点的FL2和FL3信号强度较蓝色散点强表明驯本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株耐受高葡萄糖浓度的寇氏隐甲藻驯化株，其特征在于：寇氏隐甲藻选用来自美国菌株保藏中心ATCC的(菌株代码ATCC 30556)为出发株；将初始寇氏隐甲藻ATCC 30556作为处理对象，在逐渐增补葡萄糖的by+培养基中进行多次驯化培养，每次所述驯化培养的处理对象为上一次驯化培养后藻株；驯化结束时葡萄糖浓度增加至54g/L；驯化过程共经历650天，共计130代；得到的高耐受葡萄糖的寇氏隐甲藻驯化株命名为ALE3。
【技术特征摘要】
1.一株耐受高葡萄糖浓度的寇氏隐甲藻驯化株，其特征在于：寇氏隐甲藻选用来自美国菌株保藏中心ATCC的(菌株代码ATCC30556)为出发株；将初始寇氏隐甲藻ATCC30556作为处理对象，在逐渐增补葡萄糖的by+培养基中进行多次驯化培养，每次所述驯化培养的处理对象为上一次驯化培养后藻株；驯化结束时葡萄糖浓度增加至54g/L；驯化过程共经历650天，共计130代；得到的高耐受葡萄糖的寇氏隐甲藻驯化株命名为ALE3。2.根据权利要求1所述的一株耐受高葡萄糖浓度的寇氏隐甲藻驯化株，其特征在于将所述初始寇氏隐甲藻培养于by+培养基，到35-36h可达到对数生长期中期，OD490可达到0.8；所述by+培养基的组成为：葡萄糖9g/L，酵母浸粉2g/L，海盐25g/L，pH为6.5。3.根据权利要求1所述的一株耐受高葡萄糖浓度的寇氏隐甲藻驯化株，其特征在于所述的增补了葡萄糖的by+培养基中葡萄糖浓度呈依次递增的状态，酵母浸粉2g/L，海盐25g/L；当葡萄糖浓度高于25g/L时，所述初始寇氏隐甲藻到达对数生长期中期的时间可能延长至48～72h。4.一株耐受高葡萄糖浓度的寇氏隐甲藻驯化株的制备方法，其特征在于寇氏隐甲藻选用来自美国菌株保藏中心ATCC的(菌株代码ATCC30556)为出发株；具体过程如下：所述驯化过程中，初始寇氏隐甲藻培养于250mL的锥形瓶中，瓶中装有50...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘璐，陈磊，李兴锐，张卫文，
申请(专利权)人：昆明藻能生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。