捕获组织细胞核基因组内相互作用的DNA片段的方法技术

本发明专利技术涉及一种捕获组织细胞核基因组内相互作用的DNA片段的方法，其包括以下步骤：S1：取新鲜的动物组织，碎化后用细胞筛过滤，得到含分散的组织细胞的滤液，离心收集所述组织细胞；S2：将S1得到的组织细胞重悬于甲醛中进行交联；S3：裂解S2中得到的交联的组织细胞；S4：灭活内源性酶，加入限制性内切酶酶切基因组；S5：补平S4中的限制性内切酶酶切产生的粘性末端，并加入标志物；S6：使因与蛋白结合而相互靠近的DNA片段连接；S7：将染色质片段化，捕获带有所述分子标记的片段，构建文库。通过使用本发明专利技术的方法，可对动物组织进行Hi‑C操作，扩大了Hi‑C技术的使用范围，使Hi‑C技术不局限于细胞系，而是可更多的物种组织样本可参考进行基因组学研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学实验
，更特别地，涉及捕获组织细胞核基因组内相互作用的DNA片段的方法。
技术介绍
基因组的三维构象在基因表达调控中起到重要作用，然而高级染色体的结构形成机制却仍然研究的不够透彻。高等真核生物基因表达调控通常涉及同一染色体间基因组序列元素物理相互作用。染色体构象捕获(chromosomeconformationcapture,3C)技术可以提供遥远的基因位点之间的关联性的详细信息，此关联性可以从甲醛固定的细胞核中捕获，并且可以从染色体的三维折叠方式被推断。3C技术以甲醛交联染色质为基础，通过限制酶消化和分子内连接捕获染色体构象。近年来，在第二代测序技术的迅速发展下，由3C技术衍生出来的Hi-C则是以整个细胞核为研究对象，研究整个基因组范围内基因位点之间的关联性。常规Hi-C一般使用细胞系作为研究对象，因为其染色质组成单一均匀，所以实验处理操作的程序较短，条件比较宽松，实验重复性好。但是，在个体发育、组织分化以及生理或病理发展的不同阶段中，基因互作情况很有可能各不相同，然而，对每个发育、分化阶段以及生理或病理发展阶段的组织来培养细胞系是不现实的。因此，需要一种直接对动物组织样品的细胞进行Hi-C建库的方法，以扩展Hi-C的应用范围。
技术实现思路
为解决以上问题，本专利技术提供了一种捕获组织细胞核基因组内相互作用的DNA片段的方法，其包括以下步骤：S1：取新鲜的动物组织，碎化后用细胞筛过滤，得到含分散的组织细胞的滤液，离心收集所述组织细胞；S2：将S1得到的组织细胞重悬于甲醛中进行交联；S3：裂解S2中得到的交联的组织细胞；S4：灭活内源性酶，加入限制性内切酶酶切基因组；S5：补平S4中的限制性内切酶酶切产生的粘性末端，并加入标志物；S6：使因与蛋白结合而相互靠近的DNA片段连接；S7：将染色质片段化，捕获带有所述分子标记的片段，构建文库。通过使用本专利技术的方法，可对动物组织进行Hi-C操作，扩大了Hi-C技术的使用范围，使Hi-C技术不局限于细胞系，而是可更多的物种组织样本可参考进行基因组学研究。进一步地，S1包括以下步骤：S1.1：取新鲜的动物组织，碎化至小于1mm×1mm的大小后，使用PBS清洗碎化的动物组织；S1.2：将经S1.1处理后的动物组织置于孔径为40μm的细胞筛上，缓慢加入10mLPBS，过程中挤压所述动物组织过细胞筛，收集通过所述细胞筛的含有分散的组织细胞的滤液；S1.3：所述滤液于2000g下离心5分钟，收集所述组织细胞。将组织尽量碎化有利于得到更多的分散的组织细胞，大多数动物细胞直径在20-30μm之间，因此，使用40μm的细胞筛有利于分离到单个的动物组织细胞。进一步地，S4中使用终浓度为0.3％的SDS，于37℃孵育60min灭活所述内源性酶，并且随后添加TritonX-100中和所述SDS。SDS灭活内源酶，防止染色体降解，细胞裂解液裂解细胞膜，释放细胞核进一步地，S5中所用的限制性内切酶在酶切双链DNA后产生带有5’突出的粘性末端，并且所述粘性末端被补平后与另一粘性末端补平后连接不产生所述限制性内切酶的酶切位点。使用这样的内切酶在补平并连接后不会恢复内切酶位点，因此，无需在连接之前酶活所述内切酶，简化了操作程序，缩小了工作体系，减少了污染的风险，并且提高了结果的可重复性。优选地，所述限制性内切酶为BamHI、HindIII、NcoI、ScaI、SpeI、XbaI中的一种或几种组合。优选地，在S6连接相互靠近的DNA片段后并且在S7将染色质片段化之前，还包括步骤S8：去除位于末端的标志物。在片段化之前去除末端标记物可降低结果的背景噪音。进一步地，S7中使用超声的方式使所述染色质片段化。优选地，所述标志物为生物素。优选地，所述生物素缀合于补平时向所述粘性末端添加的一种或多种核苷酸分子上。进一步地，所述动物组织为上皮组织、肌肉组织或神经组织。附图说明图1为完整基因组(第2泳道)、酶切后的基因组(第3泳道)和酶切并连接后的基因组(第4泳道)的电泳图；图2为所建的Hi-C库的2100检测图。具体实施方式以下结合实例对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。1.处理动物组织获得分散的组织细胞1)取新鲜动物组织样本1g，尽量剪碎置于有细胞筛(40μm)的50ml离心管上，加入5mL室温1×PBS清洗，弃PBS；2)缓慢持续加入10mL室温1×PBS，并用注射器活塞挤压磨碎组织样本通过细胞筛，滤液收集于50mL离心管中；3)2000gRT离心5min，吸弃上清。2.甲醛交联1)加入10mL1×PBS配制的终浓度1％的甲醛，轻微吹打重悬细胞，室温摇晃10分钟进行交联；2)加入1.11mL1×PBS配制的2.0M甘氨酸，室温摇晃5分钟终止交联；3)2000gRT离心5min，吸弃上清；4)3mL预冷1×PBS重悬细胞，每5-10x106Cell分装于一个1.5mL离心管中，4℃2000g离心5min，吸弃上清；5)交联好的组织细胞可长期-80℃冻存备用，也可干冰运输。3.裂解并灭活内源性酶1)将5×106组织细胞重悬于250μl冷的裂解液(含抑制剂)中，4℃2500g离心5min，吸弃上清；2)沉淀重悬于250μl冷的裂解液(含抑制剂)中，孵育15min；3)于4℃2500g下离心5min，吸弃上清；4)将细胞重悬于含0.3％SDS的160μl1×NEBuffer2.1中，小心吹打，37℃孵育60min；5)加入48μl10％TritonX-100，20μl10×NEBuffer2.1和132μl水以灭活SDS；6)于650g下离心5min，吸弃上清，重悬于250μl含0.5％TritonX-100的1×NEBuffer2.1。4.限制性内切酶酶切基因组每管加入1.1μl1×NEBuffer2.1和10μl10U/μl限制性内切酶(DpnII)，900rpm37℃过夜。(注意：DpnII对应的酶切缓冲液中SDS的终浓度不超过0.15％)(加酶之前以及酶切之后，每管各取20μl，补足10mMTris-HclPH8.0至100μl，加入约10μl10％SDS至终浓度1％，加5μl20mg/ml蛋白酶K，65℃过夜；酚氯仿提取DNA；加酶之前标记为G-1，酶切之后标记为D-2)。5.补平与标记将酶切后的体系于650g下离心5min，弃上清，48.9μl1×NEBuffer2.1重悬，62℃孵育20min。然后进行补平反应，补平末端并插入生物素标记碱基，补平体系如表1所示。表1补平体系10×NEBuffer2.11.1μl10mMdGTP0.3μl10mMdTTP0.3μl10mMdCTP0.3μl0.4mMbiotin-14-dATP7.5μl5U/μlKlenowpolymerase1.6μlTotal11μl加入补平体系于每个Hi-C反应(终体积60μl)，混合均匀后，37℃孵育75min。6.连接反应按表2配制连接体系，于16℃连接4h。表2连接体系7.解交联1)向反应体系中加入5μl20mg/ml蛋白酶K，于55℃孵育2h；再次加入5μl20mg/ml蛋白酶K，于55℃孵育2h至过夜；2)将反应混合液冷却到室温本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种捕获组织细胞核基因组内相互作用的DNA片段的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：取新鲜的动物组织，碎化后用细胞筛过滤，得到含分散的组织细胞的滤液，离心收集所述组织细胞；S2：将S1得到的组织细胞重悬于甲醛中进行交联；S3：裂解S2中得到的交联的组织细胞；S4：灭活内源性酶，加入限制性内切酶酶切基因组；S5：补平S4中的限制性内切酶酶切产生的粘性末端，并加入标志物；S6：使因与蛋白结合而相互靠近的DNA片段连接；S7：将染色质片段化，捕获带有所述分子标记的片段，构建文库。

【技术特征摘要】
1.一种捕获组织细胞核基因组内相互作用的DNA片段的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：取新鲜的动物组织，碎化后用细胞筛过滤，得到含分散的组织细胞的滤液，离心收集所述组织细胞；S2：将S1得到的组织细胞重悬于甲醛中进行交联；S3：裂解S2中得到的交联的组织细胞；S4：灭活内源性酶，加入限制性内切酶酶切基因组；S5：补平S4中的限制性内切酶酶切产生的粘性末端，并加入标志物；S6：使因与蛋白结合而相互靠近的DNA片段连接；S7：将染色质片段化，捕获带有所述分子标记的片段，构建文库。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S1包括以下步骤：S1.1：取新鲜的动物组织，碎化至小于1mm×1mm的大小后，使用PBS清洗碎化的动物组织；S1.2：将经S1.1处理后的动物组织置于孔径为40μm的细胞筛上，缓慢加入10mLPBS，过程中挤压所述动物组织过细胞筛，收集通过所述细胞筛的含有分散的组织细胞的滤液；S1.3：所述滤液于2000g下离心5分钟，收集所述组织细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，S4中使用终浓度为0.3％的SDS，于37...

【专利技术属性】
技术研发人员：张骥诚，虞诗诚，马志远，方涛，张会君，
申请(专利权)人：武汉菲沙基因信息有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42