本发明专利技术提供了一株抗逆性强、抑制弧菌属细菌效果明显、具有改善水质、提高对虾产量、安全可靠的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BCXE‑01，以及含有上述蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BCXE‑01的复合菌制剂及其用途。本发明专利技术的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BCXE‑01发酵液中活性物质能够耐高温、耐低pH，对副溶血弧菌、溶藻弧菌、灿烂弧菌等有较强的抑制作用。本发明专利技术中以蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BCXE‑01为主要成分制成的复合菌制剂抑制弧菌的效果优于单菌蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BCXE‑01。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术专利属于微生物及其应用领域，具体涉及一株高效抑制弧菌病的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01；还涉及一种以上述蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01为主要成分的复合菌制剂；还涉及一种以上述蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01为主要成分的复合菌制剂的制备方法。
技术介绍
自1988年凡纳滨对虾引进中国后，因其具有抗逆性强、生长速度快、耐高密度等特点，迅速成为我国对虾养殖业中养殖范围最广的品种。但随着对虾集约化养殖模式的迅猛发展，残饵粪便等有机污染物的大量积存致使大量有害菌群滋生繁殖，养殖水体的生态环境持续恶化；严重降低了对虾的抗病力，使得对虾疾病频发。目前，病害问题已是严重抑制对虾养殖业发展的重要因素之一。其中弧菌病就是对虾养殖过程中常发病之一，并且在世界各地均有对虾因弧菌病而导致高死亡率的报道。例如，由副溶血弧菌引起厄瓜多瓦、马来西亚、中国台湾、菲律宾和日本等地区爆发弧菌病而导致养殖对虾大量死亡的报道；在中国各地区也报道过因溶藻弧菌引起的弧菌病而导致对虾严重减产。故自2009年研究确定对虾“早期死亡综合症”的主要致病菌是副溶血弧菌以来，近些年弧菌便成为对虾细菌性疾病的主要致病菌之一，而且其致病性和危害性越来越大。针对对虾弧菌病的防治主要还是以抗生素类药物为主，但大量抗生素用于病害防治，会导致细菌耐药性增强及对虾体内药物残留等问题，并严重制约着对虾养殖业的健康可持续发展。益生菌具有改善水质、降低养殖水体的氨氮浓度、提高养殖对象的抗病性和抗逆性、提高养殖对象的产量等众多优点，现已成为目前抗生素类药物替代品的研究热点。故寻找一株益生菌来防治对虾养殖过程中弧菌病的发生，对对虾养殖具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一株蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01，可以对对虾养殖过程中的致病菌弧菌属细菌产生有效的抑制作用，可用于对虾养殖过程中由弧菌属细菌引起的弧菌病的有效防治。本专利技术的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏号为CGMCCNO.6940，保藏日期为2012年12月7日。本专利技术的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01的主要特征如下：1、生理生化特征(见表1)：表1蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01的生理生化特征2、菌株16SrDNA鉴定蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01，经16SrDNA鉴定，其与BacilluscereusATCC14579的同源性高达99％，经系统发育树分析得到其属于蜡样芽孢杆菌属细菌。本专利技术的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01上清液中的活性物质分子量小于10kDa，并且能够耐高温和耐低pH，对对虾养殖过程中的常见致病菌副溶血弧菌、溶藻弧菌和灿烂弧菌等有较强的抑制作用。本专利技术的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01可以有效的抑制对虾养殖池塘中弧菌的数量。本专利技术的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01是从对虾养殖区域采集的对虾肠道粪便样品中分离得到。本专利技术的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01属于安全无公害的益生菌种类。在对虾养殖过程中泼洒蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01或是包含蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01的复合菌制剂，能够有效抑制对虾养殖池塘中病原菌弧菌的数量，提高对虾养殖的产量，有效避免了抗生素的使用。本专利技术还提供了一种以蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01为主要成分的复合菌制剂，其可以提高生长状态不佳、食欲不振对虾的生长活力，促进对虾摄食和健康生长。所述复合菌制剂是由蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌以5～7:1:1的细菌数量比例复合而成。所述的地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌均购自青岛根源生物技术集团公司。所述复合菌制剂能够有效地降低对虾养殖水体中病原菌弧菌的数量，改善养殖水体，提高对虾产量。所述以复合菌制剂蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01为主要成分的复合菌制剂通过以下步骤制备：(1)种子液培养将蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌通过平板划线，分别接种到2216E固体培养基平板上，置于37℃培养24h，然后挑取单菌落分别接种于液体发酵培养基A中，于37℃、180～200rpm培养20～24h，得到3种菌的摇瓶种子液。所述发液体酵培养基A的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O0.5g，陈海水1000mL，将pH调至6.0～7.5。将配制好的液体酵培养基A于121℃灭菌30min后使用。所述2216E固体培养基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂20g，陈海水1000mL，将pH调至7.6-7.8。将配制好的2216E固体培养基于121℃灭菌30min后使用。(2)扩大培养3种菌的摇瓶种子液按蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01：地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌＝5～7:1:1的细菌数量比例接种(例如以10％的接种量，体积比)到装有液体发酵培养基B的发酵罐中，于30～37℃，搅拌速度180～200rpm，通气量为2～4V/V.min，培养24～36h。所述液体发酵培养基B：胰蛋白胨(OXOID)10g，玉米浆10g，葡萄糖10g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O0.5g，陈海水1000mL，pH6.0～7.5，121℃灭菌30min。(3)复合菌制剂的制备液体发酵制备复合菌制剂的方法：将扩大培养后的3种菌株的混合液接种(例如按10％的接种量，体积比)到装有液体发酵培养基B的发酵罐中，于30～37℃，搅拌速度180～200rpm，通气量为2～4V/V.min，培养48～72h；然后采用高速离心的方法收集上述发酵菌体。所述液体发酵培养基B的配方如下：胰蛋白胨10g，玉米浆10g，葡萄糖10g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O0.5g，陈海水1000mL，pH调至6.0～7.5。121℃灭菌30min后使用。将麦麸、沸石粉和玉米粉粉碎，然后按照1:1:1的重量比例混合均匀，所得的混合物作为辅料载体；将离心分离得到的菌体载入辅料载体，然后烘干、粉碎、混合均匀，即得复合菌制剂。所述以复合菌制剂蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01为主要成分的复合菌制剂还可以通过以下步骤制备：(1)种子液培养将蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌通过平板划线，分别接种到2216E固体培养基平板上，置于37℃培养24h，然后挑取单菌落分别接种于液体发酵培养基A中，于37℃、180～200rpm培养20～24h，得到3种菌的摇瓶种子液。所述发液体酵培养基A的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，KH2本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)BCXE‑01，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏号为CGMCC NO.6940，保藏日期为2012年12月7日。
【技术特征摘要】
1.一种蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，菌种保藏号为CGMCCNO.6940，保藏日期为2012年12月7日。2.一种权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01在抑制致病菌弧菌属细菌中的应用。3.一种以权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01为主要成分的复合菌制剂，其特征在于：所述的复合菌制剂是由蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌以5～7:1:1的细菌数量比例复合而成。4.根据权利要求3所述的以蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01为主要成分的复合菌制剂，其特征在于：所述的复合菌制剂是由蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌以5:1:1的细菌数量比例复合而成。5.根据权利要求3所述的以蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01为主要成分的复合菌制剂，其特征在于：所述的复合菌制剂是由蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌以6:1:1的细菌数量比例复合而成。6.根据权利要求3所述的以蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01为主要成分的复合菌制剂，其特征在于：所述的复合菌制剂是由蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌以7:1:1的细菌数量比例复合而成。7.一种权利要求3所述的以蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01为主要成分的复合菌制剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)种子液培养：将蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01、地衣芽孢杆菌和枯草芽胞杆菌通过平板划线，分别接种到2216E固体培养基平板上，置于37℃培养24h，然后挑取单菌落分别接种于液体发酵培养基A中，于37℃，180～200rpm培养20～24h，得到3种菌的摇瓶种子液；所述液体发酵培养基A的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，KH2PO41.5g，MgSO4·7H2O0.5g，陈海水1000mL，将pH调至6.0～7.5；所述2216E固体培养基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，琼脂20g，陈海水1000mL，将pH调至7.6-7.8；(2)扩大培养：3种菌的摇瓶种子液按蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)BCXE-01：地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌＝5～7:1:1的细菌数量比例混合后按照体积比为10％的接种量接种到装有液体发酵培养基B的发酵罐中，于30～37℃，搅拌速度180～200rpm，通气量为2～4V/V.min，培养24～...
【专利技术属性】
技术研发人员：田相利，李海东，赵坤，蒋雯雯，董双林，蔡玉勇，梁晶晶，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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