一种酶活提高的胆盐水解酶突变体制造技术

本发明专利技术公开了一种酶活提高的胆盐水解酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明专利技术通过定点突变的方式，将胆盐水解酶分子内部活性位点附近的天冬酰胺突变成疏水性更强的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，将缬氨酸突变成了异亮氨酸，改变了分子内部疏水性，显著提高了菌株表达胆盐水解酶的酶活力，改造后的菌株产酶能力显著提高，酶活力至少提高至91.32U/mL，复合突变菌株pET‑22b(+)‑bsh‑V59I/N19Y酶活提高最为显著，达到141.87U/Ml，较出发菌株提高了71.6％倍，可以提高生产效率，更适合工业应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种酶活提高的胆盐水解酶突变体，属于酶工程

技术介绍
胆盐水解酶(BSH)是由bsh基因编码的一种胞内酶，广泛存在于肠道微生物中，是降解胆汁的主要组成成份——共轭胆酸第一步所需的酶。胆酸盐水解酶可将共轭胆酸水解成牛磺酸或甘氨酸和游离胆酸，后者可由其它肠道微生物在肠道内作进一步降解。胆酸盐水解酶的生理作用体现在两个方面：一、影响宿主的脂肪代谢过程，减少脂肪的消化吸收和降低胆固醇水平等；二、胆汁的降解减少了胆汁对肠道微生物的毒性，改善了微生物生存的肠道环境；由降解产生的氨基酸和游离脂肪酸还可为微生物提供营养物质。目前报道的多数胆盐水解酶表达量低，易形成包涵体。因此，筛选一种酶活较高并能高效表达的胆盐水解酶对于工业化生产胆盐水解酶，及运用胆盐水解酶调节生物机体健康状况具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供一种酶活力提高的胆盐水解酶突变体，所述突变体是对氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的胆盐水解酶蛋白质内部氨基酸进行定点突变，将第19位天冬酰胺替换为色氨酸或酪氨酸或苯丙氨酸，并将第59位缬氨酸替换为异亮氨酸，从而提高胆盐水解酶的活性。本专利技术的第二个目的是提供表达所述胆盐水解酶突变体的细胞系。本专利技术的第三个目的是提供一种重组大肠杆菌，所述重组大肠杆菌是以pET-22b(+)为载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，表达所述突变体。本专利技术的第四个目的是提供一种酶活提高的重组大肠杆菌的构建方法，所述方法是将含有编码所述胆盐水解酶突变体的基因与表达载体连接后转化至大肠杆菌中。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是pET-22b(+)为载体、以E.coliBL21(DE3)为宿主表达所述胆盐水解酶突变体。本专利技术的第五个目的是提供一种提高胆盐水解酶活力的方法，将第19位天冬酰胺替换为色氨酸或酪氨酸或苯丙氨酸，并将第59位缬氨酸替换为异亮氨酸。本专利技术的第六个目的是提供一种生产胆盐水解酶的方法，是将所述重组大肠杆菌接种至TB培养基中，37℃培养12～30h.在本专利技术的一种实施方式中，所述接种量按体积比为1％。在本专利技术的一种实施方式中，所述菌体至OD600为0.8～1.0时，加入IPTG诱导。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法还将诱导培养后的发酵液离心，收集菌体，并破壁纯化获得纯酶。本专利技术还提供所述胆盐水解酶突变体在食品、保健品、医药配制品生产领域的应用。有益效果：本专利技术通过定点突变的方式，将胆盐水解酶分子内部活性位点附近的天冬酰胺突变成疏水性更强的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸，将缬氨酸突变成了异亮氨酸，改变了分子内部疏水性，显著提高了菌株表达胆盐水解酶的酶活力，改造后的菌株产酶能力显著提高，酶活力至少提高至91.32U/mL，复合突变菌株pET-22b(+)-bsh-V59I/N19Y酶活提高最为显著，达到141.87U/mL，较出发菌株提高了71.6％倍，可以提高生产效率，更适合工业应用。附图说明图1为出发酶与突变体对应的酶活。具体实施方式LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，pH7.0；TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmol/LKH2PO4，72mmol/LK2HPO4。胆盐水解酶活性鉴定方法：滴加5μL受体菌菌液至别含有0.01％猪胆盐(w/v)的LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素和24μg/mLIPTG)上，通过能否产生白色或透明沉淀圈检验胆盐水解酶的活性。粗酶液的制备：将发酵液6000～9000rpm离心，收集菌体后，用0.1M、pH6～7的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2～3次，并超声破碎5min，离心收集上清液即为粗酶液。胆盐水解酶酶活测定方法：取10μL酶液用0.1M磷酸盐缓冲液(pH6.0)稀释至90μL，加入10μL结合胆盐(200mM)混合，于37℃孵育30min，加入等体积的15％(w/v)三氯乙酸终止反应，离心后取10μL上清液与190μL茚三酮试剂混合，于100℃反应15min，冷却后于570nm处测定吸光值，根据甘氨酸标准曲线进行计算。其中，茚三酮试剂的组成为：0.5mL1％(w/v)茚三酮(溶解于0.5M、pH5.5柠檬酸盐缓冲液)，1.2mL甘油，0.2mL0.5M、pH5.5的柠檬酸缓冲液。实施例1高效分泌胆盐水解酶菌株构建以SEQIDNO.1所示氨基酸为模板，经过密码子优化，合成SEQIDNO.2所示基因bsh。将基因bsh1与载体pET-22b(+)进行连接，连接体系：目的基因bsh4μL，载体pET-22b(+)1μL，solutionI5μL，16℃过夜连接。将连接好的重组质粒pET-22b-bsh1转化到感受态细胞E.coilJM109中，转化氨苄青霉素LB平板，挑取阳性菌落，接种至LB培养基中，37℃摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后，转化子由上海生工进行测序。实施例2高分泌能力胆盐水解酶生产菌株的验证将实施例1中测序正确的质粒，转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃，培养12h，转接到TB培养基中，接种量为1％。菌体长到OD6001.0时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到28℃，培养36h。离心，收集菌体，检测胞内酶活。结果显示，酶活力为82.68U/mL。实施例3高酶活突变体的获得利用定点突变试剂盒(TaKaRa)，设计引物，以已构建的pET-22b-bsh1为模版，进行PCR，将胆盐水解酶分子内部活性位点附近的第19位的天冬酰胺分别突变为苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸，将第59位的缬氨酸突变为异亮氨酸，分别命名为N19F、N19W、N19Y、V59I。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。转化子由上海生工进行测序，转化子命名为pET-22b(+)-bsh-N19F、pET-22b(+)-bsh-N19W、pET-22b(+)-bsh-N19Y、pET-22b(+)-bsh-V59I。以测序正确的菌株pET-22b(+)-bsh-V59I的质粒为模版，对胆盐水解酶分子内部19位的天冬酰胺进行复合突变，分别突变为苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸，命名为V59I/N19F、V59I/N19W、V59I/N19Y，转化子由上海生工进行测序，转化子命名为pET-22b(+)-bsh-V59I/N19F、pET-22b(+)-bsh-V59I/N19W、pET-22b(+)-bsh-V59I/N19Y。实施例4高产胆盐水解酶生产菌株的验证将实施例3测序正确的质粒，分别转化至E.coilBL21(DE3)，挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃，200～220rpm培养12h，转接到TB培养基中，接种量为1～3％。菌体培养至OD600为1.2时，加入0.1mMIPTG诱导，并将培养温度降到28℃，培养36h。将发酵液6000～9000rpm离心，收集菌体后，用0.1M、pH6～7的磷酸盐缓冲液洗涤菌体2～3次，并超声破碎5min，离心收集上清液。对各重组菌的酶活进行测定，结果如图1所示。与出发菌株(实施例2构建的重组菌)比较，酶活力均有显著提高，V59I，N19本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酶活力提高的胆盐水解酶突变体，其特征在于，所述突变体是对氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的来源于长双歧杆菌的胆盐水解酶蛋白质内部氨基酸进行定点突变，将第19位天冬酰胺替换为色氨酸或酪氨酸或苯丙氨酸，并将第59位缬氨酸替换为异亮氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种酶活力提高的胆盐水解酶突变体，其特征在于，所述突变体是对氨基酸序列如SEQIDNO.1所示的来源于长双歧杆菌的胆盐水解酶蛋白质内部氨基酸进行定点突变，将第19位天冬酰胺替换为色氨酸或酪氨酸或苯丙氨酸，并将第59位缬氨酸替换为异亮氨酸。2.表达权利要求1所述胆盐水解酶突变体的细胞系。3.一种重组大肠杆菌，其特征在于，以pET-22b(+)为载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，表达所述突变体。4.一种酶活提高的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述方法是将含有编码所述胆盐水解酶突变体的基因与表达载体连接后转化至大肠杆菌中。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以pET-22b(+)为载体、以E...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹书华，
申请(专利权)人：曹书华，
类型：发明
国别省市：江苏;32