一种固定化核酸酶P1及其制备方法与其应用技术

本发明专利技术公开了一种固定化核酸酶P1的制备方法，包括如下步骤：(1)改性树脂：以表面修饰剂改性介孔树脂，得到表面改性的介孔树脂载体，所述的表面改性剂为伴刀豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚多巴胺中的一种或几种的混合物；所述的介孔树脂为环氧基树脂、氨基树脂、磺酸基树脂或者羧基化树脂；(2)核酸酶P1固定化：将步骤(1)得到的介孔树脂载体加入到0.5～6g/L核酸酶P1酶液中，核酸酶P1与树脂的质量比为10～250mg：1g，混合，在25℃振荡反应时间2～12h，抽滤得到树脂固定化核酸酶P1。本发明专利技术提供的表面改性介孔树脂微球固定化方法，核酸酶P1的催化性能高，可使RNA水解率达到95％以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体设计一种固定化核酸酶P1及其制备方法与应用。
技术介绍
近年来，由于生物催化反应具有底物特异性、反应效率高等优势而备受关注。然而生物酶在工业环境下稳定性差、耐受性差、重复利用性差及分离困难，难以实现连续化。而解决酶催化工业应用的关键技术就是固定化。核苷酸具有很高的经济价值，广泛应用于生物医药、食品、饲料和营养保健等领域。目前生产核苷酸的方法有水解法、微生物发酵法、化学合成法及自溶法等，化学合成法着重于核苷的磷酸化，生产成本高效率低，且用到有毒的化工原料，与提倡绿色产品的理念相违背；微生物发酵法生产成本低效率高，但核苷酸生产难度较大，目前仅有肌苷酸和鸟苷酸实现了工业化生产；自溶法产物浓度低，总收率较低，提取困难；酶解法利用酶水解RNA，该方法生产核苷酸成本低、收率高、操作简单，是目前主要的核苷酸生产方法。核酸酶P1是一种含锌金属酶，由桔青霉发酵生成，具有磷酸二酯酶特性，能将单链DNA和RNA水解为5’-核苷酸，是核苷酸工业化生产中最常用的一种酶。研究表明游离酶利用率低、产物底物双抑制、产品分离纯化困难，导致工业生产中难以实现连续化，因此固定化酶连续生产核苷酸的研究成为重点。树脂作为一种人工合成的介孔多聚物，具有机械强度高、稳定性好、载酶量大、易于分离、可重复使用等优点，已经被广泛用作固定化酶载体。然而该固定酶存在固定量及酶活性偏低、稳定性不够等问题，因此需要选择合适的表面修饰剂对树脂表面进行改性以提高固定化酶的固载量、酶活性及热稳定性。伴刀豆蛋白A(ConA)作为一种凝集素，对含有甘露糖或者葡萄糖的糖蛋白具有特异性的亲和力，实现酶的定向固定化，使酶在载体表面按照一定的方向排列，使底物易进入到酶的活性位点，从而改善酶的酶学性质。利用戊二醛将ConA和载体交联在一起，然后核酸酶P1的糖基部分和ConA连接起来，通过核酸酶P1的糖基部分实现酶的定向固定化，没有必须氨基酸残基参与共价结合，且避免了固定化过程中由于酶分子与交联剂直接接触对酶分子造成的化学损伤。聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone)简称PVP，是一种非离子型水溶性高分子化合物，由N-乙烯基吡咯烷酮在一定条件下聚合而成，由于其良好的水溶性、化学稳定性、生物相容性和生物惰性，在材料表面改性中逐渐表现出较好的应用前景。PVP改性载体表面具有良好的抗蛋白质吸附能力，选择性的吸附特定的蛋白，且PVP的包覆和空间位阻作用可抑制酶的团聚，使酶在载体表面均匀分布，进一步提高酶的稳定性。聚乙二醇(PEG)分子末端有两个能被活化的-OH基团，能够与水形成氢键，使其具有良好的水溶性，是一种被广泛使用的化学修饰材料。PEG无毒、无免疫原性、具有良好的生物相容性，且其生物相容性已通过美国食品和药物管理局(FDA)认证。多巴胺是一种生物神经递质，具有优良分散性、粘附性、亲水性及生物相容性等优点,在碱性有氧条件下可在几乎所有材料表面发生自聚合反应，形成一层强力黏附在固体材料表面的聚多巴胺层，成为用于酶固定化领域的一种理想材料。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种固定化核酸酶P1，以解决现有技术中游离酶利用率低、产物底物双抑制、产品分离纯化困难的问题。本专利技术还要解决的技术问题是提供上述固定化核酸酶P1的制备方法。本专利技术最后要解决的技术问题提供上述固定化核酸酶P1在水解RNA制备核苷酸中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案：一种固定化核酸酶P1的制备方法，包括如下步骤：(1)改性树脂：以表面修饰剂改性介孔树脂，得到表面改性的介孔树脂载体，所述的表面改性剂为伴刀豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚多巴胺中的一种或几种的混合物；所述的介孔树脂为环氧基树脂、氨基树脂、磺酸基树脂或者羧基化树脂；(2)核酸酶P1固定化：将步骤(1)得到的介孔树脂载体加入到0.5～6g/L核酸酶P1酶液中，核酸酶P1与树脂的质量比为10～250mg:1g，核酸酶P1与树脂的质量比优选100mg:1g，在25℃振荡反应时间2～12h，抽滤得到树脂固定化核酸酶P1。步骤(1)中，利用伴刀豆蛋白改性介孔树脂的方法如下：(1a)伴刀豆蛋白活化：将伴刀豆蛋白溶于缓冲液中，所述的缓冲液包括如下组分：0.1mol/LKCl、0.01mol/LCaCl2、0.01mol/LMnCl2、0.1mol/LKH2PO4、0.1mol/LK2HPO4、pH7.0，得到伴刀豆蛋白溶液；(1b)戊二醛活化介孔树脂：将50～200g介孔树脂加入400mL、0.1mol/LpH8.0的磷酸缓冲液，搅拌15～60min，得到戊二醛活化的介孔树脂；(1c)伴刀豆蛋白修饰介孔树脂：将戊二醛活化的介孔树脂加入伴刀豆蛋白溶液中，在25℃、150rmp下震荡6～18h，去除上清，水洗介孔树脂，得到伴刀豆蛋白修饰的介孔树脂。步骤(1)中，利用聚乙二醇、聚多巴胺、聚乙烯吡咯烷酮改性介孔树脂的方法如下：(2a)配制改性剂溶液：0.05～5g/g聚乙二醇溶液、0.1～3g/L盐酸多巴胺Tris溶液、1～5g/L聚乙烯吡咯烷酮溶液；(2b)取1～5g介孔树脂于反应容器中，加入50～300mL相应的改性剂溶液，置于25℃、120～180rmp恒温摇床中震荡，去除上清，水洗介孔树脂，得到改性的介孔树脂。步骤(2)中，所述的核酸酶P1的氨基酸序列如SEQIDNO.：1所示。上述述固定化核酸酶P1的制备方法制备得到的树脂固定化核酸酶P1在本专利技术的保护范围之内。上述树脂固定化核酸酶P1在水解RNA制备核苷酸中的应用在本专利技术的保护范围之内。本专利技术所提供的表面改性的树脂微球可以用于固定化核酸酶P1，进行连续催化水解RNA制备核苷酸，实验表明，本专利技术制备的固定化酶可使RNA的转化率保持在95％以上。本专利技术的优点和有益效果在于：(1)本专利技术提供的介孔树脂微球表面改性方法工艺简单，利用表面改性介孔树脂微球固定化酶效果明显；(2)本专利技术提供的表面改性介孔树脂微球固定化方法，核酸酶P1的催化性能高，可使RNA水解率达到95％以上；(3)本专利技术提供的表面改性介孔树脂微球固定化方法，核酸酶P1性质稳定，可重复使用。附图说明图1是本专利技术的介孔树脂微球形貌结构表征的FESEM图谱。通过FESEM表征可看出树脂微球样品呈球状形貌，直径约0.5mm。图1(b)为树脂微球横截面的FESEM图，可见微球内部结构蓬松、孔道丰富。图1(c，d)分别是对微球表面和截面的放大，可清晰看出孔道和内部多孔结构的存在。图2是戊二醛活化的介孔树脂HA-GA、伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA和固定了核酸酶P1的伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA-E的FTIR图。图3是戊二醛活化的介孔树脂HA-GA、伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA和固定了核酸酶P1的伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA-E的热重分析图。图4是戊二醛活化的介孔树脂HA-GA、伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA和固定了核酸酶P1的伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA-E的氮气吸附-脱附等温线。图5是戊二醛活化的介孔树脂HA-GA、伴刀豆蛋白A修饰的介孔树脂HA-GA-ConA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种固定化核酸酶P1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)改性树脂：以表面修饰剂改性介孔树脂，得到表面改性的介孔树脂载体；其中，所述的表面改性剂为伴刀豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚多巴胺中的一种或几种的混合物；所述的介孔树脂为环氧基树脂、氨基树脂、磺酸基树脂或者羧基化树脂；(2)核酸酶P1固定化：将步骤(1)得到的介孔树脂载体加入到0.5～6g/L核酸酶P1酶液中，核酸酶P1与树脂的质量比为10～250mg：1g，混合，在25℃振荡反应时间2～12h，抽滤得到树脂固定化核酸酶P1。

【技术特征摘要】
1.一种固定化核酸酶P1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)改性树脂：以表面修饰剂改性介孔树脂，得到表面改性的介孔树脂载体；其中，所述的表面改性剂为伴刀豆蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇、聚多巴胺中的一种或几种的混合物；所述的介孔树脂为环氧基树脂、氨基树脂、磺酸基树脂或者羧基化树脂；(2)核酸酶P1固定化：将步骤(1)得到的介孔树脂载体加入到0.5～6g/L核酸酶P1酶液中，核酸酶P1与树脂的质量比为10～250mg：1g，混合，在25℃振荡反应时间2～12h，抽滤得到树脂固定化核酸酶P1。2.根据权利要求1所述的固定化核酸酶P1的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，利用伴刀豆蛋白改性介孔树脂的方法如下：(1a)伴刀豆蛋白活化：将伴刀豆蛋白溶于缓冲液中，所述的缓冲液包括如下组分：0.1mol/LKCl、0.01mol/LCaCl2、0.01mol/LMnCl2、0.1mol/LKH2PO4、0.1mol/LK2HPO4、pH7.0，得到伴刀豆蛋白溶液；(1b)戊二醛活化介孔树脂：将50～200g介孔树脂加入戊二醛溶液中，所述的戊二醛溶液为(w/w)2％的0...

【专利技术属性】
技术研发人员：应汉杰，黄金莎，庄伟，吴菁岚，周精卫，陈勇，陈晓春，朱晨杰，柳东，牛欢青，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32