一种副猪嗜血杆菌菌株制造技术

本发明专利技术的目的提供一株副猪嗜血杆菌血清12型YBH12株，保藏编号为CCTCC M 2016636。本发明专利技术的副猪嗜血杆菌血清12型YBH12株对猪的毒力强、免疫原性好，并具有较好的交叉保护性。其制备的疫苗安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种副猪嗜血杆菌菌株。
技术介绍
猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,HPS)是猪Glasser's病的病原体，引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎等。国外对HPS流行病学调查表明，临床病猪的分离率高达20％左右。随着我国集约化猪场的发展，副猪嗜血杆菌病的发生呈上升趋势，给养猪业造成了巨大的经济损失，是近年来严重危害养猪业发展的细菌性传染病之一。副猪嗜血杆菌至少有15个血清型，不同国家或地区流行的优势血清型不同，不同血清型的致病性和免疫学特性差异显著。目前，已经证实副猪嗜血杆菌在我国绝大多数猪场存在和流行。而血清12型也日益成为临床上主要的流行血清型，因此筛选具有免疫原性好的血清12型的临床分离菌株具有十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种副猪嗜血杆菌菌株，即筛选出的一株血清12型副猪嗜血杆菌，并将其毒株制备成灭活疫苗，从而防治临床上血清12型引起的副猪嗜血杆菌病，减少给养殖场所造成的危害。本专利技术首先提供一种副猪嗜血杆菌YBH12株(HaemophilusparasuisYBH12)，于2016年11月10日保藏在中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016636。本专利技术的副猪嗜血杆菌血清12型YBH12株用于制备疫苗；所述的疫苗，优选为灭活疫苗；本专利技术还提供一种灭活疫苗，其中抗原为灭活的副猪嗜血杆菌血清12型YBH12株；上述的灭活疫苗，其中细菌抗原的灭活采用甲醛灭活；本专利技术的灭活疫苗的制备方法如下：1)油相：MONTANIDETMISA201VG佐剂；2)水相制备：将纯粹检验合格的YBH12株抗原，将菌泥分别重悬于适量灭菌的生理盐水中，均稀释至4.0×109CFU/ml灭活后，检验合格后，作为抗原。3)乳化水相和油相预热至31℃，按质量比1:1混合，4000r/min搅拌30～40分钟。4)分装定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。本专利技术的疫苗所使用的副猪嗜血杆菌血清12型YBH12株的毒力强高、免疫原性好并具有较好的交叉保护性。本专利技术制备的疫苗的安全性良好，未出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。保存期试验中经过性状、安全性试验、效力试验数据的分析，各项指标均稳定有效；效力试验结果证明，YBH12株产生抗体快，重要的是免疫后能够抵御流行株的保护。具体实施方式申请人筛选获得了一株副猪嗜血杆菌血清12型YBH12株，将菌株制备成灭活疫苗，从而促成了本专利技术。下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。实施例1：副猪嗜血杆菌血清12型YBH12株的筛选1.流行病学调查自2008年以来，我们对副猪嗜血杆菌的流行病学进行调查，并对部分猪场进行跟踪调查。调查结果发现，血清4、5、12、13型是目前流行血清型。而4、5、13型均已筛选出适宜的制苗菌株，而且三价灭活疫苗已有研制；但副猪嗜血杆菌血清12型的菌株还未进行筛选。2.细菌分离采集疑似病猪的肺脏、胸腹腔积液、心包积液、心血、关节液和脑组织等病料，接种TSA培养基，于5％CO2条件下，37℃培养24～48h，挑取单个菌落，进行培养并鉴定。3.细菌鉴定3.1形态观察取疑似菌落，涂片后革兰氏染色镜检，观察其细菌形态。3.2生化特性鉴定取疑似菌落按常规进行溶血性试验、尿素酶试验、氧化酶试验、V-P试验、接触酶试验、硝酸盐还原试验、吲哚试验、卫星生长试验；糖发酵试验，包括葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、核糖和麦芽糖。同时用HPS12型国际参考菌株作对照菌株，于37℃培养24～48h，观察结果。3.3PCR鉴定根据副猪嗜血杆菌16SrRNA序列设计引物，引物为(F：5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT–3’，R：5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT–3’)。对分离到的疑似HPS分离菌株进行PCR鉴定，PCR扩增的产物应为822bp大小的片段。3.4血清学特性鉴定采用琼脂扩散试验对副猪嗜血杆菌分离菌株进行血清型鉴定。4.毒力试验将分离的10株血清12型副猪嗜血杆菌分别腹腔注射8～10周龄健康易感仔猪各5头，3.0ml/头(活菌量均约为5.0×109CFU)，另取5头不攻毒作为对照。连续观察14日，记录试验猪的发病及死亡情况。5.免疫原性根据毒力试验结果，将筛选的毒力较强的YBH12株分离菌株菌液分别调整至2.0×109CFU/ml，甲醛灭活后与201佐剂按质量比1:1混合乳化，制备单价灭活疫苗，肌肉注射3～5周龄仔猪，2.0ml/头，每组5头。一次免疫后21日按相同剂量相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日所有仔猪采血并分离血清，使用微量凝集方法测定血清的抗体效价；并分别用本菌株进行腹腔注射攻毒(活菌量均约为6.0×109CFU)。观察试验猪的发病及死亡情况，比较不同菌株对猪的免疫原性。试验结果表明，微量凝集抗体为5/5大于等于1:32；免疫组为5/5保护，对照组为5/5发病。6.交叉攻毒保护根据毒力试验结果，将筛选的毒力较强的YBH12株分离菌株菌液调整至2.0×109CFU/ml，甲醛灭活后与201佐剂按质量比1:1混合乳化，制备单价灭活疫苗，腿部肌肉注射仔猪，2.0ml/头。一次免疫后21日按相同剂量相同方法进行二次免疫，二次免疫后14日所有仔猪分别用分离的10株同型菌株进行攻毒(6.0×109CFU)。观察14日，记录试验仔猪的发病及死亡情况。试验结果表明，YBH12株疫苗制备的单价灭活疫苗，能抵御YBH12株及其他9株分离株的攻击，攻毒保护率均为5/5，具有较好的交叉攻毒保护力。实施例2：副猪嗜血杆菌血清12型YBH12株抗原的制备1.菌液培养采用发酵罐对YBH12株进行培养：按发酵罐容积的60％～80％加入TSB培养基，同时加入消泡剂，通入高压蒸汽进行灭菌，待其温度降至37～38℃时，分别加入5％新生牛血清、0.01％NAD和3％～5％二级种子液进行发酵培养。培养温度36～37℃、搅拌转速100r/min、pH值7.2～7.4，整个培养过程通过调节进气量来控制溶氧量为60％～80％，菌液培养14小时后，取样进行活菌计数和纯粹检验。分别将发酵完成的菌液，导入柱式离心机离心，收获菌泥，置于2～8℃保存，不超过48小时。2.灭活根据活菌计数结果，将菌泥重悬于适量灭菌的生理盐水中，稀释至4.0×109CFU/ml，分别计量加入10％甲醛溶液，使其终浓度为0.2％，37℃搅拌灭活16小时，进行灭活检验，其余菌液置2～8℃保存，不超过14日。3.半成品检验3.1纯粹检验按现行《中国兽药典》附录进行检验。3.2活菌计数按现行《中国兽药典》附录进行计数。3.3灭活检验按现行《中国兽药典》附录进行检验。实施例3：疫苗的制备1水相配制检验合格的YBH12株抗原。2油相MONTANIDETMISA201VG佐剂(以下简称201佐剂)。3乳化水相和油相预热至31℃，按质量比1:1混合，4000r/min搅拌30～40分钟。3分装定量分装，加盖密封，并粘贴标签，置2～8℃保存。4成品检验4.1性状外观乳白色乳剂。剂型水包油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水表面，应呈云雾状扩散。稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种副猪嗜血杆菌，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌的保藏编号为CCTCC M 2016636。

【技术特征摘要】
1.一种副猪嗜血杆菌，其特征在于，所述的副猪嗜血杆菌的保藏编号为CCTCCM2016636。2.如权利要求1所述副猪嗜血杆菌，其特征在于，所述的副猪...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭莉莉，孙健，徐保娟，马爽，郭伟伟，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37