本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种利用乙二醇提高亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini)ST‑1羟化DHEA的方法。其特征在于，转化过程中在投加底物DHEA的同时，直接加入0.5％(v/v)的乙二醇，从而显著提高DHEA的转化效率。在底物投料量为12g/L的条件下，底物转化率高达90.4％，产物7α‑OH‑去氢表雄酮和7,15α‑diOH‑去氢表雄酮的总得率为86.8％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种添加乙二醇的方法提高亚麻刺盘孢霉(Colletotrichumlini)ST-1羟化去氢表雄酮(DHEA)为7α-羟基-去氢表雄酮(7α-OH-DHEA)和7,15α-羟基-去氢表雄酮(7,15α-diOH-DHEA)的方法。
技术介绍
去氢表雄酮(DHEA)、胆固醇、孕甾烯醇酮等一些主要的3-羟基甾体，在自然界生物体内，会转化成为相应的7α-羟基甾体衍生物。近几年来，去氢表雄酮，7α-羟基-去氢表雄酮及7,15α-羟基-去氢表雄酮的重要生物学活性，更加受到人们的重视。目前，有研究发现7α-OH-DHEA可以阻止体外神经元的缺氧细胞死亡，而且具有明显的抗氧化作用和抗肿瘤作用，可以将其作为一种具有重要药理作用和药用价值的羟基甾体化合物；而双羟化产物7,15α-羟基-去氢表雄酮(7,15α-diOH-DHEA)，作为一种重要的甾体药物中间体，可用于合成多种甾体激素类药物，如合成“第四代”口服避孕药的主要成分屈螺酮。由于上述两种去氢表雄酮的羟化产物都具有重要药理作用和药用价值，应用前景十分看好，成为当前药物研究领域中的热点之一。但是，去氢表雄酮及其羟基化衍生物为内源性物质，生物体内贮存量极低，来源受限，导致其研究工作受到了一定的限制。且其结构复杂，羟基的空间立体选择性要求高，故采用传统的全化学合成比较困难，成本高、得率低而且重污染。随着生物转化技术的兴起，利用微生物转化技术对甾体进行选择性修饰引起了人们的高度重视，该反应具有条件温和，安全低耗、易操作、转化率高且环境友好等特点。据相关文献报道，目前已有总状毛霉(Mucorracemosus)等菌株具备转化DHEA为7α-羟化报道，但对7,15α-OH-DHEA的研究极少。在利用微生物对甾体化合物进行转化的过程中，由于甾体是是脂溶性化合物，在水相中溶解度极低，从而极大限制其转化效率。针对这一问题，研究人员尝试将多种有机溶剂引入甾体生物转化过程，发现部分有机溶剂除了具有“助溶剂”效果之外，还可以被细胞体内生物酶代谢，生成辅酶NADH和NADPH，实现还原性辅酶的再生循环，常见的如使用甘油、异丙醇等化合物，但对甾体转化率的提高幅度不大。因此，在亚麻刺盘孢霉(Collectotrichumlini)ST-1羟化DHEA过程中，选用16种常见的有机溶剂进行分析，发现添加乙二醇能够显著提高DHEA的转化率和产物的总得率，而目前关于添加乙二醇用于亚麻刺盘孢羟化DHEA的方法未见报道，其显著提高底物的水溶性、转化率，降低生产成本更是工业生产的一大优势。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种添加乙二醇来提高亚麻刺盘孢霉(Collectotrichumlini)ST-1羟化去氢表雄酮的方法，通过添加适量的乙二醇，显著提高底物投料浓度，达到高转化率和高产物得率的要求。该菌于2012年4月24日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.6051，分类命名为亚麻刺盘孢霉(Collectotrichumlini)。应用上述微生物转化DHEA生产7α-OH-DHEA和7,15α-diOH-DHEA的方法，其步骤如下：(1)采用保藏号为CGMCCNo.6051的亚麻刺盘孢霉(Collectotrichumlini)ST-1为生产菌种，25-40℃，150-220r/min条件下活化培养得到种子液，然后将种子液涂布到PDA培养基上；(2)制备亚麻刺盘孢霉(Collectotrichumlini)ST-1菌株的细胞液体培养物：挑取步骤(1)的PDA固体培养基上的亚麻刺盘孢霉(Collectotrichumlini)ST-1菌株一环，接种于已灭菌的装有20-60mL种子培养基的250mL锥形瓶中，培养温度为25-40℃，置摇床上以150-220r/min的转速培养12-16h至对数生长中期，即得到亚麻刺盘孢霉(Collectotrichumlini)ST-1菌株的细胞液体培养物；(3)发酵培养：将步骤(2)中制备好的细胞液体培养物以8-10％(v/v)的接种量接入发酵培养基，装液量为250mL锥形瓶中装20-60mL发酵培养基，培养温度为25-40℃，在150-220r/min的转速下培养20-24h，得发酵液。(4)生物转化：精确称取适量DHEA，投入步骤(3)中的菌体发酵液，使其终浓度为10-15g/L，与此同时，添加0.25-1.5％(v/v)的乙二醇，在转化温度28℃，200-220r/min的转速下转化36-80h，即得转化液。(5)产物检测：将步骤(4)的转化液在8000-12000r/min下离心5-10min，上清用等体积乙酸乙酯抽提3次，沉淀用适量氯仿抽提3次，合并抽提液后于旋转蒸发仪中旋至有晶体出现，乙腈复溶晶体并通过0.22μm的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析DHEA和7α-OH-DHEA和7,15α-OH-DHEA的含量。其中步骤(1)所述种子培养基的成分及配比为：豆饼粉5-15g/L，葡萄糖20-50g/L；酵母粉10-30g/L；玉米浆1-10g/L；灭菌前调培养基的pH至6.5-7.5，在121℃高压蒸汽下灭菌20min；步骤(2)中所述的PDA培养基的成分及配比为：土豆200-500g/L；葡萄糖20-50g/L；酵母粉2-10g/L；琼脂粉10-20g/L；pH自然，在121℃高压蒸汽下灭菌20min；步骤(3)所述发酵培养基的成分及配比为：葡萄糖20-50g/L；酵母粉10-30g/L；蛋白胨5-20g/L；玉米浆1-10g/L；pH6.5-7.5，121℃高压蒸汽下灭菌20min。本专利技术所述的利用亚麻刺盘孢霉(Collectotrichumlini)ST-1羟化去氢表雄酮的方法，是首次提出在投加底物DHEA的同时，添加适量的乙二醇，最终达到高底物投料浓度、高底物转化率、高产物得率的目的，此方法对微生物转化甾体类化合物具有重要的意义。附图说明图1为本专利技术的亚麻刺盘孢霉(Collectotrichumlini)ST-1在发酵培养基中转化DHEA的过程研究。图2对照组电镜图图3乙二醇组电镜图图4C.liniST-1对乙二醇的利用情况图5乙醇酸浓度变化图6胞内NADPH浓度变化具体实施方式实施例1添加乙二醇，利用亚麻刺盘孢霉(Collectotrichumlini)ST-1羟化DHEA(1)制备亚麻刺盘孢霉(Collectotrichumlini)ST-1菌株的细胞液体培养物挑取固体PDA培养基上的亚麻刺盘孢霉(Collectotrichumlini)ST-1菌株一环，接种在装有30mL种子培养基的250mL锥形瓶中，在30℃下，置于摇床上以200r/min的转速培养20-24h至对数期，即制得亚麻刺盘孢霉(Collectotrichumlini)ST-1菌株的细胞液体培养物。(2)发酵培养基的成分及配比为：葡萄糖20-50g/L；酵母粉10-30g/L；蛋白胨5-20g/L；玉米浆1-10g/L；pH6.5-7.5，121℃高压蒸汽下灭菌20min。(3)摇瓶发酵：将上述亚麻刺盘孢霉(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用乙二醇提高亚麻刺盘孢霉(Colletotrichum lini)ST‑1羟化DHEA的方法，其特征为：250mL三角瓶装30‑50mL的发酵培养基，接种量按体积比为3‑8％，培养温度25‑40℃，摇床转速150‑220r/min，培养20‑24h后投入底物去氢表雄酮5‑15g/L和培养基总体积0.25％‑1.25％的有机溶剂乙二醇，继续转化24‑96h。
【技术特征摘要】
1.一种利用乙二醇提高亚麻刺盘孢霉(Colletotrichumlini)ST-1羟化DHEA的方法，其特征为：250mL三角瓶装30-50mL的发酵培养基，接种量按体积比为3-8％，培养温度25-40℃，摇床转速150-220r/min，培养20-24h后投入底物去氢表雄酮5-15g/L和培养基总体积0.25％-1.25％的有机溶剂乙二醇，继续转化24-96h。2.如权利要求1所述的利用亚麻刺盘孢霉(Colletotrichumlini)S...
【专利技术属性】
技术研发人员：李会，许正宏，史劲松，李聪，倪瑜，张晓梅，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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