一种单细胞全基因组的测序方法技术

本发明专利技术提供了一种单细胞全基因组的测序方法，包括以下步骤：对单细胞进行分离并裂解；对单细胞的全基因组DNA进行单细胞全基因组扩增；对扩增产物进行质量检测；对检测合格的扩增产物进行捕获并构建DNA测序文库；高通量测序；其中，对扩增产物进行质量检测包括步骤：检测该扩增产物中的DNA片段长度，将最大DNA片段的长度与预设值进行比较，判断扩增产物的质量是否合格，最大DNA片段的长度大于预设值的扩增产物，其质量检测合格。本发明专利技术对于扩增后扩增产物质量的检测方法步骤简单，不需要另外合成引物，成本低，而且检测扩增产物需要的起始量少，检测结果准确有效，具有很强的实用性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及单细胞测序领域，具体地说是一种单细胞全基因组的测序方法。
技术介绍
单细胞全基因组测序是指在单细胞水平对全基因组进行扩增与测序的一项新技术，其方法是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA先进行扩增，获得高覆盖率的完整基因组后再进行高通量测序，用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系。2014年1月《自然·方法学》(NatureMethods)上发表年度特别报道，将“单细胞测序”(Singledoutforsequencing)的应用列为2013年度最重要的方法学进展，可见单细胞测序技术的重要性。哈佛大学终身教授、美国科学院院士谢晓亮教授于2012年发表了关于多重退火和成环循环扩增技术(MultipleAnnealingandLooping-BasedAmplificationCycles，MALBAC)的论文，该技术能够降低单细胞全基因组的PCR扩增偏倚，使得单细胞中93％的基因组能够被测序，使得检测单细胞中较小的DNA序列变异变得更容易，因此能够发现个别细胞之间的遗传差异。这样的差异可以帮助解释癌症恶化的机制，生殖细胞形成机制，甚至是个别神经元的差异机制，有着广阔的应用前景。由于单细胞基因组的DNA含量为皮克级水平，而目前的测序技术要求起始DNA量为微克级水平，因此，必须先将单细胞基因组进行全基因组扩增(WGA)使之达到足够量才能进行测序，也就对核酸扩增技术(amplificationtechnology)提出了更高的要求。单细胞质量会很大程度的影响单细胞的预扩增以及全基因组的覆盖率，而面对如此微量的DNA，任何降解、样品损失、或者污染都会对测序结果带来非常严重的影响，也就无法保证扩增达到100％的成功率。鉴于单细胞基因组DNA质量的难以估量(～6pg)以及测序的昂贵成本，在测序甚至建库之前，对单细胞全基因组扩增的覆盖率进行准确的预估，是非常重要意义的。公告日为2014年4月30日，公告号为CN102533960B的中国专利中公开了“一种单细胞基因组分析方法及试剂盒”。该专利采用HousekeepingGene检测方法，对单细胞全基因组的扩增产物进行质量检测。该方法需要对位于10个不同染色体上的10个基因分别进行PCR扩增，每个反应需分别进行单独扩增和电泳检测；每个反应都需要15ng的模板量，则完成单个样品的质量检测需耗费150ng基因组扩增产物。此方法不仅繁琐，并且浪费试剂和单细胞基因组扩增样品。公布日为2015年7月8日，公布号为CN104762405A的中国专利申请中公开了“一种单细胞基因组扩增后扩增产物质量鉴定的方法和试剂盒”。该专利采用5对基因组上保守区段的特异性引物，将其放在一个扩增体系中，以全基因组扩增产物为模板进行PCR扩增，对5个扩增产物进行电泳检测，根据检测结果判断全基因组扩增产物的质量。该方法需要对位于5个不同染色体上的5个基因进行PCR扩增，PCR操作于同一反应体系，虽然可以减少模板的浪费，但同一体系中多个反应极易造成非特异性扩增。且电泳的分辨率不高，容易导致误判，影响后续测序结果的准确性。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是针对现有技术存在的不足提供一种单细胞全基因组的测序方法，该测序方法在建库测序之前能对扩增产物进行质量检测，不仅成本低，而且质控检测所需的起始量低，同时操作简单。一种单细胞全基因组的测序方法，包括以下步骤：对单细胞进行分离并裂解，得到该单细胞的全基因组DNA；对单细胞的全基因组DNA进行单细胞全基因组扩增，得到全基因组扩增产物；对扩增产物进行质量检测；对检测合格的扩增产物进行捕获并构建DNA测序文库；对建库后的数据进行高通量测序；其中，对扩增产物进行质量检测包括步骤：检测该扩增产物中的DNA片段长度，将最大DNA片段的长度与预设值进行比较，判断扩增产物的质量是否合格，最大DNA片段的长度大于预设值的扩增产物，其质量检测合格。优选的，所述将最大DNA片段的长度与预设值进行比较是指：以DNA片段长度为横坐标，DNA片段丰度为纵坐标建立曲线，通过比较尾峰位置的横坐标与预设值，评估扩增产物的质量是否合格。根据检测DNA片段长度的不同方法，DNA片段丰度可以选择不同的指标表示，例如选择荧光强度(Fluorescenceintensity)作为表示丰度的指标。优选的，所述预设值为10380bp，如果最大DNA片段的长度大于10380bp，扩增产物的质量合格。优选的，所述检测扩增产物中的DNA片段长度时，向扩增产物中加入低片段标记物和高片段标记物，其中高片段标记物的长度与预设值相同。本领域技术人员公知的，在检测DNA片段的长度时，通常会在需要检测的DNA中加入低片段标记物和高片段标记物作为参照标准。本专利技术在设定预设值时，可以将预设值作为高片段标记物的大小，加入待检测的DNA片段中，以便于观察比较最大DNA片段的长度与预设值的大小。优选的，加入预设值为10380bp的标记物时，通过比较最大DNA片段长度与预设值的大小，选择合格的扩增产物，再进行建库、测序。按照单细胞高通量测序的一般要求，靶向测序原始测序深度需达到靶向区域大小的3000x，其中>100x的覆盖率>70％，全外显子原始测序深度需达到10G，其中>1x的覆盖率>70％。在此覆盖率的基础上，可以认为单细胞全基因组扩增产物的质量合格。本领域技术人员根据本领域的公知技术和预设值的大小，可以选择不同的方式进行DNA片段长度的检测。优选的，所述扩增产物中DNA片段长度通过基于毛细管电泳的DNA分析芯片进行检测。更优选的，所述扩增产物中DNA片段长度利用安捷伦2100生物分析仪及相应的试剂盒进行检测，所述试剂盒中包含有基于毛细管电泳的DNA分析芯片。作为优选的，试剂盒可以为AgilentHighSensitivityDNAKit试剂盒。更优选的，所述扩增产物用无核酸酶水稀释至1～4ng/μL后再进行DNA片段长度的检测。该稀释后的浓度可以根据检测DNA片段长度的具体芯片进行选择进样。更优选的，单细胞全基因组扩增后，利用磁珠纯化试剂盒或者切胶回收试剂盒对扩增产物进行分离回收，然后取部分扩增产物稀释后进行DNA片段长度的检测。优选的，所述单细胞全基因组扩增采用MALBAC方法进行扩增。本专利技术通过检测最大的DNA片段长度来检测单细胞全基因组扩增产物是否合格，从而在高通量测序的建库步骤之前就可以检测单细胞质量，对合格的扩增产物进行后续的建库，不合格的扩增产物则无需进行后续高通量测序的步骤，去除大量不合格的扩增样品，从而控制下游上机测序文库的质量，能从很大程度上避免不必要的浪费。本专利技术对于扩增后扩增产物质量的检测方法步骤简单，不需要另外合成引物，成本低，而且检测扩增产物需要的起始量少，检测结果准确有效，具有很强的实用性。附图说明图1为合格扩增产物的芯片鉴定图；图2为不合格扩增产物的芯片鉴定图；上述图1和图2中，横坐标为DNA片段大小，纵坐标为荧光强度(Fluorescenceintensity)；图中，1-低片段标记物峰、2-高片段标记物峰、3-尾峰；图3为细胞1-6的单细胞全基因组扩增产物的芯片鉴定图；图4为细胞1-11的单细胞全基因组扩增产物的芯片鉴定图；图5为细胞2-1的单细胞全基因组扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单细胞全基因组的测序方法，其特征在于：包括以下步骤：对单细胞进行分离并裂解，得到该单细胞的全基因组DNA；对单细胞的全基因组DNA进行单细胞全基因组扩增，得到全基因组扩增产物；对扩增产物进行质量检测；对检测合格的扩增产物进行捕获并构建DNA测序文库；对建库后的数据进行高通量测序；其中，对扩增产物进行质量检测包括步骤：检测该扩增产物中的DNA片段长度，将最大DNA片段的长度与预设值进行比较，判断扩增产物的质量是否合格，最大DNA片段的长度大于预设值的扩增产物，其质量检测合格。

【技术特征摘要】
1.一种单细胞全基因组的测序方法，其特征在于：包括以下步骤：对单细胞进行分离并裂解，得到该单细胞的全基因组DNA；对单细胞的全基因组DNA进行单细胞全基因组扩增，得到全基因组扩增产物；对扩增产物进行质量检测；对检测合格的扩增产物进行捕获并构建DNA测序文库；对建库后的数据进行高通量测序；其中，对扩增产物进行质量检测包括步骤：检测该扩增产物中的DNA片段长度，将最大DNA片段的长度与预设值进行比较，判断扩增产物的质量是否合格，最大DNA片段的长度大于预设值的扩增产物，其质量检测合格。2.根据权利要求1所述单细胞全基因组的测序方法，其特征在于：所述将最大DNA片段的长度与预设值进行比较是指：以DNA片段长度为横坐标，DNA片段丰度为纵坐标建立曲线，通过比较尾峰位置的横坐标与预设值，判断扩增产物的质量是否合格。3.根据权利要求1所述单细胞全基因组的测序方法，其特征在于：所述预设值为10380bp，如果最大DNA片段的长度大于10380bp，扩增产物的质量合格。4.根据权利要求1所述单细胞全基因组的...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈昌岳，李静，甘广利，张祥林，杨飞，占雪峰，赵慧茹，
申请(专利权)人：上海美吉医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31