一种替考拉宁的提纯方法技术

本发明专利技术提供一种替考拉宁的提纯方法，该提纯方法该方法是将替考拉宁发酵液依次进行树脂富集、树脂纯化、膜浓缩、喷雾干燥操作。本发明专利技术的方法与现有技术相比，极性大孔吸附树脂与粒径均一的中等极性层析树脂结合使用，产品收率高，脱色效果好；喷雾干燥技术，避免了丙酮的大量使用，不仅仅保护了环境，降低成本，更避开了现有技术中有机溶剂的残留问题；通过本发明专利技术纯化方法得到的替考拉宁各组分比例符合EP标准，提纯工艺高效便捷、制备量大，适于工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于制药工程领域，具体涉及一种替考拉宁的提纯方法。
技术介绍
替考拉宁(teicoplanin)是继万古霉素之后开发的另一种抗耐药菌的糖肽类抗生素。现有替考拉宁生产方法中，一般采用微生物发酵生产替考拉宁为主，发酵液中替考拉宁，包括TAl～TA2，其中TA2是替考拉宁的主要活性成分，主要由5个化学结构十分相似的化合物(TA2-1，TA2-2，TA2-3，TA2-4，TA2-5)组成；其粗品及精制品中还含有一个活性组分TA3-1，该化合物是TA2的去酰基葡萄糖胺产物；此外，其中还含有2个亲脂性较强的类似物。替考拉宁化学结构如下式一所示。目前，制药领域遵循的标准中，《欧洲药典》(EP)对各个组分做出了明确的规定，A2组之和不小于80.0％，其中A2-2为35.0％～55.0％，A2-1、A2-3、A2-4、A2-5均不大于20.0％，A3-1不大于15.0％，不纯组分不大于5.0％。现有替考拉宁主要的提纯方法有：溶媒萃取法、吸附法、离子交换法和色谱层析法等。溶媒萃取法分离纯化效果差，收率低，目前该法很少采用；文献[参照M.R.巴尔顿(M.R,Bardon)等的JournalofAntibiotics，第31卷，第3号，第170-177页(1978年3月)]表述离子交换法对替考拉宁提纯的影响，强酸性离子交换树脂会使替考拉宁的部分糖成分发生分解，应用强碱性离子交换树脂，会使替考拉宁发生差向异构化，生物学活性降低；公开号为CN101302248A的中国专利、公开号为US2005245481A1的美国专利均公开了液相层析法提纯替考拉宁，但这些专利所公开的提纯方法对于A2各组分比例不能很好的控制，不能达到欧洲药典的标准，且提纯时间长，生产周期长。申请号为CN201210221636.X的中国专利公开了一种利用纳米聚合物微球制备替考拉宁精粉的方法，该方法部分实现了产品中单组份的含量可控；然而，纳米聚合物微球成本较高，难以大规模推广。此外，中国专利申请号为CN200710107185.6公开了一种采用GE公司的葡聚糖凝胶或琼脂糖类凝胶层析制备高纯度替考拉宁的生产方法，但因葡聚糖凝胶和琼脂糖类凝胶价格昂贵，并不适合工业化生产。因此，现有替考拉宁的提纯方法中，比较成熟与常用的还是树脂吸附法；其将发酵液碱化后过滤，滤液经树脂吸附后，用解吸剂对树脂进行解吸，解吸液经过活性炭脱色，然后滤液加溶剂沉淀，过滤即得替考拉宁湿品，最后用树脂或层析剂进行进一步精制，其中的树脂主要为大孔吸附树脂，解吸剂为有机溶剂的水溶液，最后加大量的溶剂进行沉淀。上述树脂吸附法在具体的工业生产中虽然已经得到较为充分的认可，但也存在着如下的缺陷：第一目前树脂吸附法所采用的树脂大多为非极性大孔吸附树脂，其对替考拉宁各组分比例的控制影响较大，脱色去杂效果不尽理想；第二就是最后的沉淀操作，通常采用加入丙酮，至90％丙酮浓度，析出替考拉宁，这样需要用到大量的丙酮，大大地加重环保的压力，又影响生产环境和人员健康。有鉴于此，研究出一种能够适合工业化生产、并对环境友好的提纯替考拉宁的树脂吸附法是从业人员所迫切希望地。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种替考拉宁的提纯方法，不仅对环境友好，而且能够适合工业化生产。本专利技术是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种替考拉宁的提纯方法，该提纯方法具体包括如下操作步骤：(1)树脂富集：取替考拉宁发酵液并将其pH值调至10.0～12.0，接着进行过滤得替考拉宁滤液；之后替考拉宁滤液以每小时0.2～2倍填充床体积的速率泵入经预处理的极性大孔吸附树脂层析柱，且极性大孔吸附树脂层析柱的树脂颗粒大小为20～60目；然后采用纯化水洗至无色，再以每小时0.2～2倍填充床体积的洗脱速率、用强极性溶剂的水溶液作解析液进行梯度洗脱，每梯度洗脱所用的解析液为3～5倍填充床体积，并收集富集液，即得替考拉宁富集液；(2)树脂纯化：将步骤(1)所得的替考拉宁富集液采用等体积纯化水稀释，之后以每小时0.2～2倍填充床体积的速率通过预处理的中等极性大孔吸附树脂柱，接着采用纯化水洗至无色，然后以每小时0.2～2倍填充床体积的洗脱速率，用强极性溶剂的缓冲盐水溶液作解析液进行等度洗脱，并分步收集洗脱液，合并有效洗脱液即得合并液，采用高效液相色谱法检测所得合并液的组分比例，当测得合并液中替考拉宁各组分符合EP要求时，则调整合并液pH值至6.8～7.4；(3)膜浓缩：将步骤(2)调整pH值后的合并液采用纳滤膜进行浓缩，且在浓缩期间加入3～5倍合并液体积的纯化水，则获得替考拉宁浓缩液；(4)喷雾干燥：将步骤(3)所获得的替考拉宁浓缩液经恒流泵以1～5L/h流速泵入进行喷雾干燥，即可得符合EP标准的替考拉宁干品。进一步地，所述步骤(1)中，过滤采用板框过滤。进一步地，所述步骤(1)中，极性大孔吸附树脂层析柱的树脂是以丙烯酰胺为基质的。进一步地，所述步骤(1)中，极性大孔吸附树脂层析柱的树脂为HT60树脂。进一步地，所述步骤(1)中，梯度洗脱的梯度依次分别为体积比10:90、20:80、30:70、40:60的强极性溶剂-水的溶剂系统。进一步地，所述步骤(2)中，中等极性大孔吸附树脂柱的树脂是以聚丙烯酸酯为基质的，且树脂颗粒大小为100目。进一步地，所述步骤(2)中，中等极性大孔吸附树脂柱的树脂为HN60树脂。进一步地，所述步骤(2)中，强极性溶剂的缓冲盐水溶液是用体积比为40:60的强极性溶剂与缓冲盐水溶液配制而成，且缓冲盐水溶液的浓度为0.05mol/L、pH值为2.5。进一步地，所述步骤(1)、步骤(2)中，强极性溶剂均为低元醇；所述缓冲盐水溶液中的缓冲盐为磷酸二氢钠或磷酸二氢钾的一种。进一步地，所述强极性溶剂为甲醇或乙醇的一种。进一步地，所述步骤(3)中，纳滤膜为聚酰胺膜，其截留分子量为100～1000D；优选截留分子量为500D。进一步地，所述步骤(4)中，喷雾干燥采用喷雾干燥机进行，且其具体条件为：喷雾干燥机进口温度90～100℃、出口温度70～80℃本专利技术的有益效果在于：通过采用极性大孔吸附树脂与粒径均一的中等极性层析树脂配合使用，使得所得产品即符合EP标准的替考拉宁干品收率高，脱色效果好；结合喷雾干燥，避免了有机溶剂的使用，不仅保护了环境、降低成本，更避开了现有技术中有机溶剂的残留问题；另外，本专利技术提纯方法得到的替考拉宁各组分比例符合EP标准，操作高效便捷、制备量大，适于规模化生产。【附图说明】下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的描述。图1是本专利技术中链霉菌发酵产生的替考拉宁发酵液的HPLC图谱。图2是本专利技术中实施例1过HT60树脂替考拉宁富集液HPLC图谱。图3是本专利技术中实施例1过HN60树脂替考拉宁合并液HPLC图谱。图4是本专利技术中实施例1喷雾干燥制得的替考拉宁的HPLC图谱。【具体实施方式】本专利技术一种替考拉宁的提纯方法，该提纯方法具体包括如下操作步骤：(1)树脂富集：取替考拉宁发酵液并将其pH值调至10.0～12.0，接着进行过滤得替考拉宁滤液；之后替考拉宁滤液以每小时0.2～2倍填充床体积的速率泵入经预处理的极性大孔吸附树脂层析柱，且极性大孔吸附树脂层析柱的树脂颗粒大小为20～60目；然后采用纯化水洗至无色本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种替考拉宁的提纯方法，其特征在于：该提纯方法具体包括如下操作步骤：(1)树脂富集：取替考拉宁发酵液并将其pH值调至10.0～12.0，接着进行过滤得替考拉宁滤液；之后替考拉宁滤液以每小时0.2～2倍填充床体积的速率泵入经预处理的极性大孔吸附树脂层析柱，且极性大孔吸附树脂层析柱的树脂颗粒大小为20～60目；然后采用纯化水洗至无色，再以每小时0.2～2倍填充床体积的洗脱速率、用强极性溶剂的水溶液作解析液进行梯度洗脱，每梯度洗脱所用的解析液为3～5倍填充床体积，并收集富集液，即得替考拉宁富集液；(2)树脂纯化：将步骤(1)所得的替考拉宁富集液采用等体积纯化水稀释，之后以每小时0.2～2倍填充床体积的速率通过预处理的中等极性大孔吸附树脂柱，接着采用纯化水洗至无色，然后以每小时0.2～2倍填充床体积的洗脱速率，用强极性溶剂的缓冲盐水溶液作解析液进行等度洗脱，并分步收集洗脱液，合并有效洗脱液即得合并液，采用高效液相色谱法检测所得合并液的组分比例，当测得合并液中替考拉宁各组分符合EP要求时，则调整合并液pH值至6.8～7.4；(3)膜浓缩：将步骤(2)调整pH值后的合并液采用纳滤膜进行浓缩，且在浓缩期间加入3～5倍合并液体积的纯化水，则获得替考拉宁浓缩液；(4)喷雾干燥：将步骤(3)所获得的替考拉宁浓缩液经恒流泵以1～5L/h流速泵入进行喷雾干燥，即可得符合EP标准的替考拉宁干品。...

【技术特征摘要】
1.一种替考拉宁的提纯方法，其特征在于：该提纯方法具体包括如下操作步骤：(1)树脂富集：取替考拉宁发酵液并将其pH值调至10.0～12.0，接着进行过滤得替考拉宁滤液；之后替考拉宁滤液以每小时0.2～2倍填充床体积的速率泵入经预处理的极性大孔吸附树脂层析柱，且极性大孔吸附树脂层析柱的树脂颗粒大小为20～60目；然后采用纯化水洗至无色，再以每小时0.2～2倍填充床体积的洗脱速率、用强极性溶剂的水溶液作解析液进行梯度洗脱，每梯度洗脱所用的解析液为3～5倍填充床体积，并收集富集液，即得替考拉宁富集液；(2)树脂纯化：将步骤(1)所得的替考拉宁富集液采用等体积纯化水稀释，之后以每小时0.2～2倍填充床体积的速率通过预处理的中等极性大孔吸附树脂柱，接着采用纯化水洗至无色，然后以每小时0.2～2倍填充床体积的洗脱速率，用强极性溶剂的缓冲盐水溶液作解析液进行等度洗脱，并分步收集洗脱液，合并有效洗脱液即得合并液，采用高效液相色谱法检测所得合并液的组分比例，当测得合并液中替考拉宁各组分符合EP要求时，则调整合并液pH值至6.8～7.4；(3)膜浓缩：将步骤(2)调整pH值后的合并液采用纳滤膜进行浓缩，且在浓缩期间加入3～5倍合并液体积的纯化水，则获得替考拉宁浓缩液；(4)喷雾干燥：将步骤(3)所获得的替考拉宁浓缩液经恒流泵以1～5L/h流速泵入进行喷雾干燥，即可得符合EP标准的替考拉宁干品。2.根据权利要求1所述一种替考拉宁的提纯方法，其特征在于：所述步骤(1)中，过滤采用板框过滤。3.根据权利要求1所述一种替考拉宁的提纯方法，其特征在于：所述步骤(1)中，极性大孔吸附树脂层析柱的...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨煌建，张祝兰，连云阳，王德森，任林英，高振云，刘珣，
申请(专利权)人：福建省微生物研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35