一种猪圆环病毒2型抗原纯化浓缩方法技术

本发明专利技术提供一种猪圆环病毒2型抗原纯化浓缩方法，涉及生物医学技术领域。一种猪圆环病毒2型抗原纯化浓缩方法，包括以下步骤：（1）将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的接头蛋白加入猪圆环病毒2型抗原中，混匀，孵育；（2）加入纯化载体，混匀，孵育；所述纯化载体为乳酸乳球菌骨架；（3）离心，取沉淀。本发明专利技术纯化浓缩方法，能够除去大量杂蛋白，抗原回收效率高、浓缩倍数高，对设备要求低，操作简单，成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医学
，具体的说，涉及到一种猪圆环病毒2型抗原纯化浓缩方法。
技术介绍
猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2,PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原。自1991加拿大首次报道PMWS以来，该病现已波及世界各地，是全球公认的危害养猪业的重要传染病之一，在我国猪群中流行也十分严重。利用疫苗免疫预防是解决PCV2流行问题的关键。目前我国在PCV2的疫苗研发及生产过程中，还存在一些未解决的重要问题：一、PCV2体外增殖能力差，抗原滴度较低，通过优化培养条件提高抗原滴度作用不显著且提高有限；二、目前市场上销售的PCV2疫苗大部分是全病毒灭活疫苗，其中细胞蛋白、牛血清蛋白等占95％以上，大面积接种此类疫苗存在一定的副反应，且会造成宿主免疫资源浪费、疫苗的免疫保护效力较差等问题。国内目前在圆环疫苗生产上尚未有较为成熟的纯化方法，个别企业生产中使用膜过滤澄清技术配合中空纤维浓缩技术等物理学纯化工艺进行纯化浓缩，这种方法能够在一定程度上将抗原进行浓缩、去除部分的杂蛋白，但却存在操作复杂、对技术设备要求高，纯化浓缩成本较高且抗原回收率较低、浓缩倍数较低等缺陷，因此，在圆环病毒疫苗生产上亟需能够高效、廉价纯化浓缩制苗抗原的方法，用以解决制苗抗原含量不足、纯度低的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪圆环病毒2型抗原纯化浓缩方法，能够除去大量杂蛋白，抗原回收效率高、浓缩倍数高，对设备要求低，操作简单，成本低。本专利技术的另一目的是提供猪圆环病毒2型疫苗，该疫苗所含抗原纯度高，生产成本低，免疫效果好，能够减轻免疫副反应，提高疫苗的安全性。本专利技术的目的采用如下技术方案实现：一种猪圆环病毒2型抗原纯化浓缩方法，包括以下步骤：(1)将氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的接头蛋白加入猪圆环病毒2型抗原中，混匀，孵育；(2)加入纯化载体，混匀，孵育；所述纯化载体为乳酸乳球菌骨架；(3)离心，取沉淀。在本专利技术中，步骤(1)中孵育条件如下：孵育过程中震荡，孵育温度为35-37℃，孵育时间为45min-60min。在本专利技术中，步骤(2)中孵育条件如下：孵育过程中震荡，孵育温度为20-30℃，孵育时间为25min-35min。在本专利技术中，接头蛋白加入比例如下：108.1TCID50的PCV2抗原中加入80～100μg的接头蛋白。在本专利技术中，纯化载体加入比例如下：108.1TCID50的PCV2抗原中加入2.3×109～2.7×109个纯化载体。在本专利技术中，所述接头蛋白是通过诱导表达携带所述接头蛋白编码基因的重组菌获得的。优选的技术方案中，所述重组菌是将接头蛋白编码基因插入表达载体pET32中NdeⅠ和HindⅢ酶切位点之间，然后导入大肠杆菌后获得的；所述接头蛋白编码基因的序列如SEQIDNO：2所示。优选的技术方案中，所述重组菌在36-37℃培养1-2h，然后在18-22℃培养2-4h，在14-16℃静置10-20min，然后加入终浓度为0.05-0.15mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷在14-16℃诱导培养18-22h，获得接头蛋白。在本专利技术中，所述乳酸乳球菌骨架是将乳酸乳球菌采用盐酸煮沸后得到的。本专利技术还提供猪圆环病毒2型疫苗，含有所述纯化浓缩方法获得的沉淀。本专利技术相对于现有技术的有益效果：本专利技术PCV2抗原纯化浓缩方法中，由于接头蛋白可以特异性地与PCV2抗原和乳酸乳球菌骨架结合，因此本专利技术方法能够高效除去大量杂蛋白，纯化浓缩PCV2抗原，抗原回收效率高、浓缩倍数高，对设备要求低，操作简单，成本低。本专利技术方法对PCV2抗原的回收效率高于99％，杂蛋白去除效率高于90％。本专利技术猪圆环病毒2型疫苗，生产成本低，免疫效果好，减少了免疫副反应，提高了疫苗安全性。附图说明图1是重组表达质粒pET-PL酶切鉴定结果，其中M为DNA标准分子量，1为未酶切重组质粒pET-PL，2、3为重组质粒pET-PL的NdeⅠ、HindⅢ双酶切产物。图2显示了接头蛋白鉴定结果，图2(A)和图2(B)分别是接头蛋白诱导表达SDS-PAGE鉴定结果和Western-blot鉴定结果，其中图2(A)中泳道1为诱导表达后重组菌PL/BL21全菌，2为诱导表达后对照菌株pET/BL21，M为预染标准蛋白分子量，3为诱导表达重组菌PL/BL21裂解液上清，4为诱导表达后重组菌PL/BL21裂解液沉淀。图2(B)M为预染标准蛋白分子量，1为诱导表达后对照菌株pET/BL21裂解液上清，2为诱导表达后重组菌PL/BL21裂解液上清。图3为接头蛋白与纯化载体结合及解离SDS-PAGE鉴定结果，其中泳道1为接头蛋白上清，泳道2为上清1，M为预染标准蛋白分子量，泳道3为沉淀1，泳道4为上清2，泳道5为沉淀2。图4为PCV2抗原纯化浓缩鉴定结果，其中图4(A)、(B)和(C)分别为PCR、SDS-PAGE电泳和PCV2特异性Western-blot鉴定结果，其中M为标准蛋白(或DNA)分子量，泳道1为沉淀4，泳道2为未纯化PCV2抗原，泳道3为上清3，泳道4为沉淀3；图4(D)和图4(E)分别为纯化PCV2抗原复合物间接免疫荧光和电镜观察鉴定结果，其中1为纯化载体，2为沉淀4，3为沉淀3。图5为PCV2抗原复合物免疫仔猪抗体检测结果，其中图5(A)为免疫第五周各组抗体水平，图5(B)为免疫后抗体持续期。具体实施方式实施例1重组表达质粒pET-PL的构建与鉴定设计接头蛋白，接头蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，该蛋白是一个融合蛋白，该融合蛋白含有两个功能识别区，能够分别特异性识别PCV2抗原和乳酸乳球菌骨架，该接头蛋白的编码基因如SEQIDNO:2所示。为了便于鉴定接头蛋白，在SEQIDNO:1所示序列的羧基端添加His标签蛋白(HHHHHH)，在接头蛋白编码基因终止密码子之前添加His标签蛋白编码序列，得到序列SEQIDNO:3，另外在5’端设计NdeI酶切位点、3’分别设计HindIII酶切位点，送金斯瑞公司合成。将合成的基因片段插入pUC载体，得到重组质粒pUC-PL。采用内切酶NdeⅠ和HindⅢ对重组质粒pUC-PL和原核表达载体pET32a进行双酶切，将接头蛋白目的基因片段(缩写为PL片段)和表达载体片段回收，通过T4连接酶连接，得到重组表达载体。pUC-PL和pET32a质粒双酶切体系(30μL)：其中10×Q.cutBuffer、Q.cutNdeⅠ和Q.cutHindⅢ购自大连宝生物有限公司。将双酶切体系混匀后置于37℃条件下作用30min，经琼脂糖凝胶电泳分离条带，切胶，按照AXYGEN胶回收试剂盒说明，分别回收目的片段PL和pET32a载体片段，通过T4连接酶连接。T4连接酶连接体系如下(25μL)：将上述连接体系置于16℃条件下，连接12-16h，得到连接产物。将上述连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，涂布含有50mg/mL氨苄青霉素的LB平板，置于37℃条件下静置过夜培养，挑取单克隆接种含有50mg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基培养过夜，按照AXYGEN质粒提取试剂盒说明操作，提取质粒，用Q.cutNdeⅠ和Q.cutHindⅢ进行双酶切鉴定，酶切产本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪圆环病毒2型抗原纯化浓缩方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的接头蛋白加入猪圆环病毒2型抗原中，混匀，孵育；(2)加入纯化载体，混匀，孵育；所述纯化载体为乳酸乳球菌骨架；(3)离心，取沉淀。

【技术特征摘要】
1.一种猪圆环病毒2型抗原纯化浓缩方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将氨基酸序列如SEQIDNO:1所示的接头蛋白加入猪圆环病毒2型抗原中，混匀，孵育；(2)加入纯化载体，混匀，孵育；所述纯化载体为乳酸乳球菌骨架；(3)离心，取沉淀。2.根据权利要求1所述猪圆环病毒2型抗原纯化浓缩方法，其特征在于步骤(1)中孵育条件如下：孵育过程中震荡，孵育温度为35-37℃，孵育时间为45min-60min。3.根据权利要求1或2所述猪圆环病毒2型抗原纯化浓缩方法，其特征在于步骤(2)中孵育条件如下：孵育过程中震荡，孵育温度为20-30℃，孵育时间为25min-35min。4.根据权利要求3所述猪圆环病毒2型抗原纯化浓缩方法，其特征在于接头蛋白加入比例如下：108.1TCID50的PCV2抗原中加入80～100μg的接头蛋白。5.根据权利要求4所述猪圆环病毒2型抗原纯化浓缩方法，其特征在于纯化载体加入比例如下：108.1TCID50的PCV2抗原中加入2.3×109～...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔绪稳，于晓明，郑其升，李鹏成，陈瑾，侯立婷，张元鹏，侯继波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32