本发明专利技术提供了一种蝎毒素多肽及制备拥有类似天然生理功能的蝎毒素多肽的方法；该方法通过基因合成的方法制备蝎毒素多肽的基因，并构建到带有His6纯化标签及SUMO助溶标签的重组质粒中，利用大肠杆菌表达体系进行高效表达。细胞破碎后经镍柱纯化，酶切去除助溶标签，经HPLC纯化后最终获得具有类似天然生理功能的蝎毒素多肽。本发明专利技术制备过程简单，成本低，产量高，制备的蝎毒素多肽具有与天然蝎毒素多肽相同的生理活性。
【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术涉及蛋白质多肽药物领域，尤其涉及一种制备类似天然生理功能蝎来源多肽毒素多肽的方法。二、
技术介绍
目前已知的蝎毒素多肽或其类似物的获取方式有三种：其一是直接从蝎子来源的粗毒中提取，经过反相高效液相色谱C18柱分离纯化，从中分离出毒液中多种单一的组分。这种方法可以获得天然蝎毒素多肽，但是缺点在于得到的蝎毒素量非常微小，1毫克粗毒经过分离纯化，仅仅可以获得微克级目的毒素多肽，同时对于大规模生产操作不便。其二是采用拮抗剂-融合蛋白的形式，将毒素多肽序列接在人血清白蛋白(HSA)或者Fc融合蛋白上，应用脂质体2000进行转染表达，应用树脂或色谱系统进行纯化。但这种方法制备出的是融合蛋白，而非多肽自身，其药效相比多肽自身亦有所下降(半抑制浓度IC50为13nM)。其三是采用化学合成来制备，这种方法在自动化肽合成仪上进行固相肽合成获取粗制直链产物，需要再经过二硫键重构和HPLC纯化过程，才能得到有活性的蝎毒素多肽。三、
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提供一种操作简便，产率高，成本低的制备拥有类似天然生理功能的蝎毒素多肽的方法。本专利技术请求保护一种蝎毒素多肽，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。所述多肽的DNA序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术同时请求所述多肽基因在制备蝎毒素多肽中的应用。在具体应用中，本专利技术提供一种制备拥有类似天然生理功能的蝎毒素多肽的方法，包括以下步骤：1)获取蝎毒素多肽蛋白的DNA序列，所述DNA序列如SEQIDNo.1所示；2)将蝎毒素多肽的DNA序列连接到带有His6亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上，构建pET28-His6-SUMO-FactorXa-蝎毒素质粒；3)将所构建的质粒转化进入大肠杆菌，培养后采用异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thio-galactoside，IPTG)诱导表达，离心后收菌，获得细菌悬液；4)将细菌悬液超声破碎后离心取上清液，用镍柱纯化，洗脱后得到纯化的His6-SUMO-FactorXa-蝎毒素多肽融合蛋白；5)将His6-SUMO-FactorXa-蝎毒素融合蛋白用FactorXa酶进行酶切，得到含有His6-SUMO标签和蝎毒素多肽毒素的蛋白混合液，将该混合液与镍柱混合，His6-SUMO标签与镍柱结合，而蝎毒素多肽毒素则作为流穿液被收集；6)将收集的蝎毒素多肽毒素，用HPLC进一步纯化，收集HPLC相应峰对应的蝎毒素多肽蛋白，并质谱验证该多肽蛋白的分子量大小，冻干备用。作为优选，所述步骤3中蛋白表达的具体步骤如下：1)将pET28-His6-SUMO-FactorXa-蝎毒素质粒测序验证，验证正确后，将其转化入EscherichiacoliBL21(DE3)gold感受态细胞中；2)在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上37℃恒温生长24h；3)挑选单克隆体，接种于4mL含50μg/mL卡那霉素的LB小管中，37℃摇床过夜扩增；4)将过夜培养的菌液加入到600mL含50μg/mL卡那霉素的LB液态培养基中(NaCl10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L)，37℃，转速为225rpm培养，OD600达到0.8时加入终浓度为0.8mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thio-galactoside，IPTG)进行诱导，转移至25℃，转速为225rpm培养，20h后，4000rpm离心20min，弃去上清，菌体沉淀使用30mL裂解液(70mMTris，300mMNaCl，pH8.0)重悬备用。作为优选，所述步骤4中蛋白纯化的具体方法如下：1)细菌悬液在冰水浴中用超声破碎仪将细胞以30％功率，3son/3soff的脉冲破碎15min，重复2-3次，待细胞悬液透亮后，在4℃环境下，14000rpm离心20min，取上清液，与用Bindingbuffer(20mMTris，200mMNaCl，pH8.0)平衡过的Ni-NTA胶混合，在4℃环境中混合孵育1h；2)将孵育后的Ni-NTA胶和上清的混合物加入重力流穿柱中，使目的蛋白截留在流穿柱上，用含30mM咪唑的Bindingbuffer洗去结合在Ni-NTA胶上的杂蛋白，接着用300mM咪唑的Bindingbuffer洗脱目的多肽蛋白，获得纯化的His6-SUMO-FactorXa-蝎毒素多肽融合蛋白。作为优选，所述步骤5中蛋白酶切的具体方法如下：1)将纯化的His6-SUMO-FactorXa-蝎毒素多肽融合蛋白经过10KMWCO浓缩管(Millipore)离心浓缩后，置入FactorXa的酶切缓冲液(20mMTris-HCl，100mMNaCl，5mMCaCl2，pH8.0)中；2)将FactorXa酶按照1:3000(g/g)的比例加入多肽融合蛋白中，20℃-25℃酶切16h；3)酶切后与平衡好的Ni-NTA胶(20个柱体积水清洗，20个柱体积Bindingbuffer平衡)混合1h，加入重力流穿柱中，使酶切下来的助溶标签截留在流穿柱上，收集流穿液，即为酶切完成的蝎毒素多肽。作为优选，所述步骤6中HPLC进一步纯化的具体方法如下：1)将蝎毒素多肽冻干，加入ddH2O溶解，2)在高效液相色谱(HPLC)C18色谱柱上使用1％到69％线性梯度的乙腈(含有0.1％TFA)以5mL/min流速分离，谱峰于214nm和254nm波长检测，蝎毒素多肽在17min-24min出峰，收集对应的多肽蛋白，然后将收集的多肽蛋白溶液冻干，得到白色固体粉末，用ESI-MS(电喷雾电离质谱)进行验证。本专利技术蝎毒素多肽是一种发现于伊朗黄蝎(Odonthobuthusdoriae)毒液，该多肽能够专一性抑制钾离子通道Kv1.3(半抑制浓度IC50为7.2nM)，而对其他Kv1.x通道及hERG通道无作用或作用很弱，因此可以用作选择性鉴别Kv1.3离子通道的多肽工具药。同时，Kv1.3是效应记忆TEM细胞上的重要药物靶点，其抑制剂具有治疗自身免疫性疾病的潜在药物可能，因此该多肽同时具有药物开发的潜能。与已有技术相比，本专利技术有益效果体现在：本专利技术提供的方法能获得较为大量的蝎毒素多肽(平均每1L的菌液能获取4mg的蝎毒素多肽)，其药效及选择性类似天然状态蝎毒素多肽的生理功能。该方法实验周期短暂(从摇菌开始，3天的时间即可获得所需的蝎毒素多肽)，产量高，纯度高，成本低，且拥有类似天然状态下的蝎毒素多肽的生理功能。四、附图说明图1是蝎毒素纯化的SDS-PAGE图。图1中：M：lowrangeproteinmarker(Da)；1：超声破碎后的全细胞样品；2：离心后的上清；3：挂镍柱之后的流穿；4：30mM咪唑洗脱的杂蛋白；5：300mM咪唑洗脱的目的蛋白；6：FactorXa酶酶切之前。7：FactorXa酶酶切之后，新切出来的条带为蝎毒素(框中)。图2是蝎毒素酶切后镍柱纯化SDS-PAGE图。图2中：M：lowrangeproteinmarker(Da)1：FactorXa酶酶切之前。2：FactorXa酶酶切之后。3：反挂Ni-NTA胶流穿。4：反挂Ni-NTA胶300mM咪唑洗脱6His-sumo-tag。图3是蝎毒素纯化的HPLC图。图4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蝎毒素多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种蝎毒素多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2.一种蝎毒素多肽基因，其特征在于，所述多肽的DNA序列如SEQIDNo.1所示。3.权利要求2所述多肽基因在制备蝎毒素多肽中的应用。4.一种制备拥有类似天然生理功能的蝎毒素多肽的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)获取蝎毒素多肽蛋白的DNA序列，所述DNA序列如SEQIDNo.1所示；(2)将蝎毒素多肽的DNA序列连接到带有His6亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上，构建pET28-His6-SUMO-FactorXa-蝎毒素质粒；(3)将质粒转化进到宿主菌中获得重组菌，培养收集菌液；(4)洗脱纯化菌液，得纯化的SUMO-蝎毒素多肽融合蛋白；(5)将SUMO-蝎毒素多肽融合蛋白用FactorXa酶进行酶切，得到含有His6-SUMO标签和蝎毒素多肽毒素的蛋白混合液；将该混合液与镍柱混合，His6-SUMO标签与镍柱结合，而蝎毒素多肽毒素则作为流穿液被收集，并用HPLC进一步纯化。(6)收集HPLC相应峰对应的蝎毒素多肽蛋白，并质谱验证该多肽的分子量大小，冻干备用。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)的具体步骤为：将pET28-His6-SUMO-FactorXa-蝎毒素质粒经过测序验证正确后，将其转化入EscherichiacoliBL21(DE3)gold感受态细胞中，在含50μg/mL卡那霉素的LB平板上37℃恒温生长24h；挑选单克隆体接种于4mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB小管中，37℃摇床过夜扩增；将过夜培养的菌液加入到600mL含50μg/mL卡那霉素的LB液态培养基中(NaCl10g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L)，37℃，转速为225rpm培养；OD600达到0.8时加入终浓度为0.8mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thio-galactoside，IPTG)进行诱导，转移至25℃，转速为225r...
【专利技术属性】
技术研发人员：田长麟，张隆华，肖亮，周莉，
申请(专利权)人：中国科学技术大学先进技术研究院，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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