一种炭角目菌植物内生菌及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种炭角目菌植物内生菌，该菌株于2016年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.12248。本发明专利技术还公开了一种炭角目菌植物内生菌在转化三七总皂苷制备越南参皂苷R13、三七皂苷J、西洋参皂苷L16的应用。本发明专利技术操作简单、转化特异性强、反应条件温和，微生物次级代谢产物少，提取发酵产物简单；转化率高，可用于皂苷的大量制备，实现皂苷的产业化。

Endophytic bacteria of carbon corner fungus and application thereof

The invention discloses a carbon angle bacteria. Endophytic bacteria, the strain in May 10, 2016 is preserved in the general microbiology center, Chinese microbe preservation management committee address: Beijing Chaoyang District City, No. 1 Beichen West Road, No. 3 hospital, Institute of Microbiology Chinese Academy of Sciences China preservation, No. CGMCC NO.12248. The present invention also discloses the application of the endophytic bacteria of the endophytic fungus in the production of R13 37, J 37 and L16. The invention has the advantages of simple operation, high specificity, mild conversion reaction conditions, microbial secondary metabolites, extraction of fermentation products is simple; the conversion rate is high, can be used for the preparation of a large number of saponins, saponins to realize industrialization.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于天然产物提取领域，具体地说，涉及一种炭角目菌植物内生菌及应用。
技术介绍
皂苷越南参皂苷R13-、三七皂苷J-)、西洋参皂苷L16-是二/三醇型皂苷，具有广泛的生物活性，对心脑血管、抗肿瘤、神经和免疫系统等方面作用独特且具有潜在的多种活性。因其结构复杂，化学合成尚不可行，需从三七、人参、越南参、绞股蓝等植物中提取获得，但因植物中含量较低，且植物资源有限，为此，利用有限的人参二/三醇型人参皂苷获得大量越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-方法更为可行简便。目前，常用的生物转化三七总皂苷获得越南参皂苷R13-、三七皂苷J-)、西洋参皂苷L16-的方法多采用微生物发酵或提取微生物粗酶法对皂苷骨架支链结构进行烯基氧化和糖水解，获得皂苷结构的改变。微生物发酵法的菌株来源相对复杂，且筛选具有活性或高活性的菌株相对难度大、筛选成功率低、通常选择几百株菌才可筛选出几株有皂苷转化活性的菌株，一般转化率不是很高且转化过程及转化产物种类(包括发酵微生物的自身次级代谢产物)相对复杂；提取微生物粗酶法，转化特异性高，条件温和，无需微生物发酵所需的培养基，产物目标性明确且不会产生微生物自身的次级代谢产物，但是由于酶的蛋白质属性，且从微生物中提取分离纯化有皂苷转化活性的酶难度大，且纯化后的酶需要溶解在缓冲液中保持酶活力，同时酶回收较困难等一系列问题。所以获得一种高皂苷转化活性，特异性强，次生产物少的菌株发酵和粗酶转化方法对于获得工业化生产皂苷越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-十分重要。
技术实现思路
为了提高皂苷越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-的含量，解决微生物发酵法和粗酶转化三七总皂苷获得三七皂苷转化率低的不足，本专利技术提出了一种炭角目菌植物内生菌及应用，使用该种炭角目菌植物内生菌，操作简单，转化特异性强，微生物次级代谢产物少，提取发酵产物简单；本专利技术为工业化生产越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-提供了一种简便方法，可通过三七总皂苷的生物转化制备获得大量的越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种炭角目菌植物内生菌，该菌株于2016年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.12248。本专利技术还公开了一种上述炭角目菌植物内生菌在转化三七总皂苷制备越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-的应用。进一步地，该应用包括以下步骤：(1)采用常规PDB培养基或马丁氏培养基活化培养炭角目菌植物内生菌；(2)将步骤(1)活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比0.02％～15％，摇床培养2～5d；(3)按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：3～1：10的比例，用体积百分比浓度为70％～75％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡三七总皂苷10～30min后，在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤(2)培养结束后的菌液中，继续摇床培养6～12d，其中三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.02％～3％；(4)发酵培养结束后，采用超声法破碎菌丝团，超声时间10～30min，然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体，发酵液用水饱和正丁醇等体积萃取3～4次，合并上层正丁醇相，减压蒸发浓缩，即得富含皂苷(越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-)的转化后总皂苷产物；所述炭角目菌植物内生菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO.12248。进一步地，步骤1)中的采用常规PDB培养基或马丁氏培养基活化培养炭角目菌植物内生菌具体为：取4℃斜面保藏的炭角目菌植物内生菌进行活化培养，培养基采用PDB培养基或马丁氏培养基，将微生物从保藏试管斜面挑取接入250ml锥形瓶中，每瓶含100ml已灭菌培养基，接菌过程在无菌环境进行；灭菌条件：121℃，20～30min；置于20～30℃，摇床培养3～5d，转速设置在100～180r·min-1。进一步地，所述PDB培养基的配制如下：取新鲜市售马铃薯200g，切成3～5mm见方小块，加水1000ml加热微沸30～50min，用4～7层纱布过滤，补足水至1L，然后添加葡萄糖20g，混匀分装灭菌备用。进一步地，马丁氏培养基的配制如下：取KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O0.5g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10g，加水定容1L。进一步地，该应用包括以下步骤：(1)采用常规PDB培养基或马丁氏培养基活化培养炭角目菌植物内生菌Xylarialessp.；(2)将步骤(1)活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比0.02％～15％，摇床培养5～8d；，5000～12000r·min-1离心，取上清液用醇沉法分离出粗酶，然后10000～12000r·min-1离心分离获得粗酶沉淀，按1g粗酶添加磷酸缓冲液0.1～2L的比例，用pH6.00～7.00磷酸缓冲液涡旋震荡溶解粗酶沉淀；(3)按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：3～1：10的比例，用体积百分比浓度为70％～75％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡10～30min后，在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤(2)培养结束后的菌液中，继续摇床培养6～12d，其中三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.02％～3％；然后轻轻震摇转化1～5d，即转化获得富含越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-的转化后三七总皂苷。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)与一般的微生物发酵法相比，转化效率高，转化部位特异性高，经鉴定分析得出，该菌株可高效特异性地转化三七总皂苷中皂苷结构的烯基，使其C-24(25)位支链上的烯基进行氧化双羟基化。发酵结束后经TLC检测发现发酵后总皂苷中无明显的原有人参皂苷物质，故推测三七总皂苷中原有人参皂苷均被羟基化，经9g三七总皂苷转化后即得富含越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-的转化后三七总皂苷，最终越南参皂苷R13-、三七皂苷J(NotoginsenosideJ)、西洋参皂苷L16-含量为31.04％，19.73％，6.22％。分离纯化后获得2.79g越南参皂苷R13-、1.78g三七皂苷J-、0.56g西洋参皂苷L16-。本专利为国家自然基金，项目名称：高等真菌中倍半萜类化学成分及其生物活性研究，资助金额48万，项目编号(21562029)。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例中方法如无特殊说明，均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。实施例1菌的分离与鉴定一、菌的分离(一)2011年11月，选取植物组织，流水冲洗晾干，用75％乙醇浸泡1min，2％的NaClO浸泡3min，然后用蒸馏水漂洗3次，切成4mm×4mm小块。(二)用无菌镊子将其铺于PDB培养基，其中添加少量氨苄青霉素和硫酸链霉素抑制细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种炭角目菌植物内生菌，其特征在于，该菌株于2016年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.12248。

【技术特征摘要】
1.一种炭角目菌植物内生菌，其特征在于，该菌株于2016年5月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.12248。2.权利要求1所述的炭角目菌植物内生菌在转化三七总皂苷制备越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用常规PDB培养基或马丁氏培养基活化培养炭角目菌植物内生菌；(2)将步骤(1)活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比0.02％～15％，摇床培养2～5d；(3)按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：3～1：10的比例，用体积百分比浓度为70％～75％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡三七总皂苷10～30min后，在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤(2)培养结束后的菌液中，继续摇床培养6～12d，其中三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.02％～3％；(4)发酵培养结束后，采用超声法破碎菌丝团，超声时间10～30min，然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体，发酵液用水饱和正丁醇等体积萃取3～4次，合并上层正丁醇相，减压蒸发浓缩，即得富含皂苷(越南参皂苷R13-、三七皂苷J-、西洋参皂苷L16-)的转化后总皂苷产物；所述炭角目菌植物内生菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO.12248。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述步骤1)中的采用常规PDB培养基或马丁氏培养基活化培养炭角目菌植物内生菌具体为：取4℃斜面保藏的炭角目菌植物内生菌进行活化培养，培养基采用PDB培养基或马丁氏培养基，将微生物从保藏试管斜面挑取接入2...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔秀明，杨晓艳，郭从亮，陈子明，曲媛，杨野，刘迪秋，王承潇，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53