不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒及构建方法技术

本发明专利技术公开了一种不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒及构建方法和应用，属于涉及生物基因工程技术领域。本发明专利技术通过人工合成DNA寡核苷酸片段制作成多克隆位点接头，基于膀胱组织特异性启动子UPII控制溶瘤腺病毒EIA基因的表达，并在UPII启动子上游插入前列腺干细胞抗原增强子PSCAE以增强UPII启引子的活性，构建出膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad5/F11p‑PSCAE‑UPII‑E1A，其能显著抑制CAR低表达的膀胱癌细胞的增殖，具有膀胱癌特异性复制能力，并呈剂量及时间依赖性。

And the construction of bladder cancer specific oncolytic adenovirus method does not depend on CAR

The invention discloses a bladder cancer specific oncolytic adenovirus and construction method and application of CAR does not depend on, is relates to the technical field of biological genetic engineering. The present invention is made into the multiple cloning sites through joint synthetic DNA oligonucleotides, the expression of UPII oncolytic adenovirus EIA gene in bladder tissue specific promoter and UPII promoter based in upstream insertion of prostate stem cell antigen enhancer PSCAE to enhance UPII and primer activity to construct bladder cancer specific oncolytic adenovirus Ad5/F11p PSCAE UPII E1A, the low expression of CAR can significantly inhibit the proliferation of bladder cancer cells, with bladder cancer specific replication competent, and in a dose and time dependent.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物基因工程
，具体涉及一种不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒及构建方法和应用。
技术介绍
膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，其有两种不同的类型：非浸润性(浅表性)膀胱癌和浸润性膀胱癌，两者无论在形成的分子机制和来源，以及治疗和愈后等方面都完全不同。目前临床治疗膀胱肿瘤多采用以手术为主，辅以放疗、化疗和膀胱灌注等方法的综合治疗，但其治愈率远未令人满意。传统的化疗和放疗存在抗肿瘤能力较低、杀伤指数较小、副作用大等缺点。膀胱癌尤其是肌肉浸润性膀胱癌，对多种化疗药物存在耐药，治疗效果远远不能令人满意。因此，探索新的治疗理念、策略和途径，以提高膀胱癌的疗效就显得非常迫切。随着分子生物学、病毒学研究的进展，肿瘤的病毒基因疗法成为近年来肿瘤生物治疗的研究热点。国内外学者通过大量的体外和体内实验研究膀胱癌的基因治疗，结果证实以腺病毒为载体的基因治疗对膀胱癌具有显著的疗效。科萨奇-腺病毒受体(coxsackieandadenovirusreceptor，CAR)在肿瘤腺病毒载体基因治疗过程中起着关键性的作用。另外，利用膀胱与体外相通的解剖学特点，将手术、化疗、放疗与膀胱腔内灌注溶瘤腺病毒结合来治疗膀胱癌，是一种非常有前景的综合治疗策略。溶瘤腺病毒(Oncolyticadenovirus)又称条件复制型腺病毒(Conditionallvreplicativeadenovirus.CRAd)，是通过对腺病毒的基因进行改造，使病毒能选择性地在肿瘤细胞内复制、增殖，具有肿瘤特异性，而对正常细胞几乎没有影响，这使其在具有良好疗效的同时保证了安全性。溶瘤腺病毒在肿瘤细胞内复制、增殖，并导致肿瘤细胞裂解，同时释放出子代病毒，子代病毒产生级联放大效应，进而感染周围的肿瘤细胞，最终消灭全部肿瘤。传统的5型腺病毒是通过特异性的CAR受体介导的胞吞作用进入宿主细胞的，这种受体是一种分子量为46kDa的具有典型细胞间粘附分子和免疫球蛋白样结构的跨膜蛋白。然而CAR在低分化或者恶性程度高的肿瘤细胞往往表达较低，这限制了5型腺病毒转染肿瘤细胞的效率。Ad11腺病毒属于B族腺病毒，病毒受体为CD46分子而不是CAR，构造含Ad5和Ad11杂合纤维顶球的嵌合型腺病毒载体Ad5/F11p转染膀胱肿瘤细胞可以克服上述问题。因而，我们构建了新的不依赖CAR的溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A，可以实现有效杀伤CAR表达阳性和阴性的膀胱肿瘤细胞，实现针对各类膀胱癌基因治疗的有效性，进一步揭示提高放化疗的有效途径，提高膀胱癌生物治疗的水准，为其它肿瘤治疗提供了理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A及构建方法和应用。为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案。一种不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒，是利用膀胱组织特异性启动子UPII控制溶瘤腺病毒EIA基因的表达，并在UPII启动子上游插入前列腺干细胞抗原增强子(PSCAE)以增强UPII启引子的活性，构建出膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A。所述不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的构建方法，具体包括以下步骤：(1)穿梭质粒的构建①多克隆位点接头(MCSLinker)的制作：合成DNA寡核苷酸片段RO-301及RO-302，RO-301的序列如SEQIDNO.1所示，RO-302的序列如SEQIDNO.2所示；②将RO-301和RO-302各以200mM溶于水中，等体积混合，95℃加热变性，然后缓慢冷却到室温复性为多克隆位点接头；③在限制性内切酶BamHI-NotI间把MCS接头插入RpS-TOAD质粒构建新的RpS-FROG质粒，从RpS-TOAD-PSE-PBN-EIA质粒中酶切得EIA片段，在Sall-NotI间把E1A片段插入RpS-FROG质粒构建新的pCRAd质粒，用引物RO-311和RO-312从质粒CPll31中扩增hUPII启动子片段，在NheI-BamHI间把hUPII启动子片段插入pCRAd质粒构建新的Rp-UPII-EIA质粒；所述引物RO-311的序列如SEQIDNO.3所示，所述引物RO-312的序列如SEQIDNO.4所示；(2)在大肠杆菌BJ5183中同源重组产生重组腺病毒质粒①把大肠杆菌BJ5183的电转化感受态细胞和电穿孔小杯置于冰上，每管感受态细胞是20μl；用PmeI酶切穿梭质粒Rp-PSCAE-UPII-E1A使其线性化，酚-氯仿抽提DNA，乙醇沉淀，重悬于6μl的MilliporeH2O中，把PmeI酶切的穿梭质粒Rp-PSCAE-UPII-E1A和1μl的100ng/μl的Ad5/F11p载体加入20μl的J5183的电转化感受态细胞中；②把感受态BJ5183转移到2.0mm电穿孔小杯中，避免形成气泡，电转化在2.0mm小杯中进行，电转化仪设定条件为输出电压2500伏特、电阻200欧姆、电容25uF，重悬转化物到0.5mlLB培养基中，37℃振荡10-20分钟；③在3-5个卡那霉素LB平板上涂板，37℃培养16-20小时，挑选10-20个小克隆，在2ml含有卡那霉素的LB培养基中培10-15小时，常规碱裂解法小量提取质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小，用pAdEasy-1作对照；④用PacI酶切提取的质粒DNA，把正确的重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中保存。本专利技术还同时提供了上述溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A在制备治疗膀胱癌药物中的应用。本专利技术通过人工合成DNA寡核苷酸片段制作成多克隆位点接头，基于膀胱组织特异性启动子UPII控制溶瘤腺病毒EIA基因的表达，并在UPII启动子上游插入前列腺干细胞抗原增强子PSCAE以增强UPII启引子的活性，构建出膀胱癌特异性溶瘤腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A，其能显著抑制CAR低表达的膀胱癌细胞的增殖，具有膀胱癌特异性复制能力，并呈剂量及时间依赖性。附图说明图1是本专利技术构建的Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A质粒的结构示意图(a)；PCR鉴定重组腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A的结果图(b)。图2是Ad5-PSCAE-UPII-E1A及Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A感染膀胱癌细胞后Hexon及E1A蛋白表达的比较。具体实施方式下面以实施例结合附图说明进一步对本专利技术作详细的阐述，但不应理解为对本专利技术的限制。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。1.穿梭质粒的构建合成DNA寡核苷酸片段RO-301及RO-302，RO-301的序列如SEQIDNO.1所示，RO-302的序列如SEQIDNO.2所示；将RO-301和RO-302各以200mM溶于水中，等体积混合，95℃加热变性，然后缓慢冷却到室温复性为多克隆位点接头；在限制性内切酶BamHI-NotI间把MCS接头插入RpS-TOAD质粒构建新的RpS本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)穿梭质粒的构建1)多克隆位点接头(MCS Linker)的制作：合成DNA寡核苷酸片段RO‑301及RO‑302，RO‑301的序列如SEQ ID NO.1所示，RO‑302的序列如SEQ ID NO.2所示；2)将RO‑301和RO‑302各以200mM溶于水中，等体积混合，95℃加热变性，然后缓慢冷却到室温复性为多克隆位点接头；3)在限制性内切酶BamHI‑NotI间把MCS接头插入RpS‑TOAD质粒构建新的RpS‑FROG质粒，从RpS‑TOAD‑PSE‑PBN‑EIA质粒中酶切得EIA片段，在Sall‑NotI间把E1A片段插入RpS‑FROG质粒构建新的pCRAd质粒，用引物RO‑311和RO‑312从质粒CPll31中扩增hUPII启动子片段，在NheI‑BamHI间把hUPII启动子片段插入pCRAd质粒构建新的Rp‑UPII‑EIA质粒；从Rp‑UPII‑E1A质粒中切除EIA片段构建新的Rp‑UPII‑Null质粒，从pBK‑CMV‑Luc质粒中酶切得到Luc片段，在BamHI‑NotI间把Luc片段插入切掉EIA片段的Rp‑UPII‑E1A质粒中，构建新的Rp‑UPII‑Luc质粒；所述引物RO‑311的序列如SEQ ID NO.3所示，所述引物RO‑312的序列如SEQ ID NO.4所示；(2)在大肠杆菌BJ5183中同源重组产生重组腺病毒质粒1)把大肠杆菌BJ5183的电转化感受态细胞和电穿孔小杯置于冰上。每管感受态细胞是20μl；2)用Pme I酶切穿梭质粒使其线性化，酚‑氯仿抽提DNA，乙醇沉淀，重悬于6μl的Millipore H2O中。把Pme I酶切的穿梭质粒和1μl的100ng/μl的Ad5/F11p载体加入20μl的BJ5183的电转化感受态细胞中；3)把感受态BJ5183转移到2.0mm电穿孔小杯中，避免形成气泡，电转化在2.0mm小杯中进行，2500伏特，200欧姆和25uF；4)重悬转化物到0.5ml LB培养基中，37℃振荡10‑20分钟，在3‑5个卡那霉素LB平板上涂板，37℃培养16‑20小时；5)挑选10‑20个小克隆，在2ml含有卡那霉素的LB培养基中培10‑15小时，碱裂解法小量提取质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小，用pAdEasy‑1作对照；6)用Pac I酶切提取的质粒DNA，把正确的重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中保存；(3)重组质粒转染HEK293细胞包装出重组腺病毒Ad5/F11p‑PSCAE‑UP II‑E1A1)用Pac I酶切5‑6μg的重组腺病毒质粒DNA40μl酶切反应体系如下：37℃水浴至少2‑4小时；2)反应管中加入60μl H20，总体积为100μl，按体积比1∶1加入酚、氯仿缓慢抽提5分钟，12000rpm离心6分钟；3)转移上清液，按体积比24∶1加入氯仿、异戊醇缓慢抽提5分钟，12000rpm离心6分钟；4)转移上清液，加入pH7.0l/10体积的3mol/l NaAc和2.5倍体积的95％乙醇，‑20℃沉淀30分钟后，12000rpm离心10分钟；5)弃上清，用700μl 70％乙醇洗沉淀，12000rpm离心10分钟，弃上清，置于37℃恒温箱中20分钟；6)待线性质粒DNA干燥后，溶于20μl Millipore水中，将15μl线性化质粒DNA加入250μl无抗生素无血清的DMEM培养基中，轻轻混和，除菌过滤，10μl Lipofectamine 2000加入2501μl无抗生素无血清的DMEM培养基中，轻轻混和后等5分钟。30分钟内混合上述DNA和脂质体，DNA加入脂质体中，混合后适温孵育20分钟，混合物可能会变浑；7)6孔板中达到90‑95％汇合度的HEK293细胞，用无抗生素无血清的DMEM培养基换液，每孔加入600μl，将混合物加入培养孔中，轻轻混合，次日观察，并加入1ml 10％FBS的DMEM培养基；8)7天后收获病毒，蚀斑纯化后，用HEK293细胞增殖，按照标准方法用CsCl梯度离心纯化病毒，用260nm吸光度法检测腺病毒颗粒滴度，用HEK293细胞检测病毒感染滴度，用PCR检测重组腺病毒Ad5/F11p‑PSCAE‑UPII‑E1A病毒的正确性；(4)重组腺病毒Ad5/F11p‑PSCAE‑UP II‑E1A的扩增和纯化1)培养HEK293细胞在10‑15个75cm2培养瓶中，待细胞铺满培养瓶底80％时，弃去培养液，加入腺病毒上清液，每15‑20min缓慢左右、前后晃动培养瓶一次，连续3次，放于37℃ 5％CO2培养箱中2‑3h，之后加入含5％血清DMEM培养基8ml，置于37℃，5％CO2培养箱继续培养，每天观察细胞变化...

【技术特征摘要】
1.一种不依赖于CAR的膀胱癌特异性溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：(1)穿梭质粒的构建1)多克隆位点接头(MCSLinker)的制作：合成DNA寡核苷酸片段RO-301及RO-302，RO-301的序列如SEQIDNO.1所示，RO-302的序列如SEQIDNO.2所示；2)将RO-301和RO-302各以200mM溶于水中，等体积混合，95℃加热变性，然后缓慢冷却到室温复性为多克隆位点接头；3)在限制性内切酶BamHI-NotI间把MCS接头插入RpS-TOAD质粒构建新的RpS-FROG质粒，从RpS-TOAD-PSE-PBN-EIA质粒中酶切得EIA片段，在Sall-NotI间把E1A片段插入RpS-FROG质粒构建新的pCRAd质粒，用引物RO-311和RO-312从质粒CPll31中扩增hUPII启动子片段，在NheI-BamHI间把hUPII启动子片段插入pCRAd质粒构建新的Rp-UPII-EIA质粒；从Rp-UPII-E1A质粒中切除EIA片段构建新的Rp-UPII-Null质粒，从pBK-CMV-Luc质粒中酶切得到Luc片段，在BamHI-NotI间把Luc片段插入切掉EIA片段的Rp-UPII-E1A质粒中，构建新的Rp-UPII-Luc质粒；所述引物RO-311的序列如SEQIDNO.3所示，所述引物RO-312的序列如SEQIDNO.4所示；(2)在大肠杆菌BJ5183中同源重组产生重组腺病毒质粒1)把大肠杆菌BJ5183的电转化感受态细胞和电穿孔小杯置于冰上。每管感受态细胞是20μl；2)用PmeI酶切穿梭质粒使其线性化，酚-氯仿抽提DNA，乙醇沉淀，重悬于6μl的MilliporeH2O中。把PmeI酶切的穿梭质粒和1μl的100ng/μl的Ad5/F11p载体加入20μl的BJ5183的电转化感受态细胞中；3)把感受态BJ5183转移到2.0mm电穿孔小杯中，避免形成气泡，电转化在2.0mm小杯中进行，2500伏特，200欧姆和25uF；4)重悬转化物到0.5mlLB培养基中，37℃振荡10-20分钟，在3-5个卡那霉素LB平板上涂板，37℃培养16-20小时；5)挑选10-20个小克隆，在2ml含有卡那霉素的LB培养基中培10-15小时，碱裂解法小量提取质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳检测质粒大小，用pAdEasy-1作对照；6)用PacI酶切提取的质粒DNA，把正确的重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中保存；(3)重组质粒转染HEK293细胞包装出重组腺病毒Ad5/F11p-PSCAE-UPII-E1A1)用PacI酶切5-6μg的重组腺病毒质粒DNA40μl酶切反应体系如下：37℃水浴至少2-4小时；2)反应管中加入60μlH20，总体积为100μl，按体积比1∶1加入酚、氯仿缓慢抽提5分钟，12000rpm离心6分钟；3)转移上清液，按体积比24∶1加入氯仿、异戊醇缓慢抽提5分钟，12000rpm离心6分钟；4)转移上清液，加入pH7.0l/10体积的3mol/lNaAc和2.5倍体积的95％乙醇，-20℃沉淀30分钟后，12000rpm离心10分钟；5)弃上清，用700μl70％乙醇洗沉淀，12000rpm离心10分钟，弃上清，置于37℃恒温箱中20分钟；6)待线性质粒DNA干燥后，溶于20μlMillipore水中，将15μl线性化质粒DNA加入250μl无抗生素无血清的DMEM培养基中，轻轻混和，除菌过滤，10μlLipofectamine2000加入2501μl无抗生素无血清的DMEM培养基中，轻轻混和后等5分钟。30分钟内混合上述DNA和脂质体，DNA加入脂质体中，混合后适温孵育20分钟，混合物可能会变浑；7)6孔板中达到90-95％汇合度的HEK293细胞，用无抗生素无血清的DMEM培养基换液，每孔加入600μl，将混合物加入培养孔中，轻轻混合，次日观察，并加入1ml10％FBS的DMEM培养基；8)7天后收获病毒，蚀...

【专利技术属性】
技术研发人员：王志平，曹文娟，田俊强，高彦俊，郭琦，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62