一种发酵培养基及鼠李糖脂的生物制备方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵培养基及鼠李糖脂的生物制备方法，包括如下步骤：(1)将鼠李糖脂生产菌种子液接入铁限制的发酵培养基中进行发酵培养；将纳米颗粒加入所述发酵培养基中；(2)用酸沉淀冷冻干燥法提取所得发酵液的鼠李糖脂。本发明专利技术运用致病能力较弱的缺失群体感应基因lasR的突变菌株，在适当的培养条件下以合适的纳米颗粒刺激鼠李糖脂的合成，这不仅能促进鼠李糖脂的分泌，而且大大降低了生产过程中的健康风险，同时具有成本低、操作简单的特点。

Biological preparation method of fermentation medium and rhamnolipid

The invention discloses a fermentation medium and rhamnolipid biological preparation method comprises the following steps: (1) the production of rhamnolipid fermentation liquid seed access iron limitation culture fermentation medium; nanoparticles are added to the fermentation medium; (2) extracted from the fermentation broth of Rhamnus glycolipids by acid precipitation and freeze drying method. The lack of quorum sensing gene mutant strain lasR of the invention by the pathogenic ability weak, under appropriate culture conditions with nanoparticles suitable to stimulate synthesis of rhamnolipid, which not only can promote the secretion of rhamnolipid, and greatly reduce the production process of health risk, also has the characteristics of low cost, simple operation.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物合成领域与纳米材料应用领域，具体涉及一种高效无害化的鼠李糖脂生物制备方法。
技术介绍
表面活性剂能使目标溶液表面张力显著下降，是一类重要的化工原料，素有“工业味精”之称，它在石油工业、环境工程、食品工业、精细化工等许多领域中占有特殊和重要的地位。目前，几乎所有的表面活性剂都是以石油为原料化学合成而来，化学合成的表面活性剂在生产和使用过程中常常会带来严重的环境污染问题。生物表面活性剂是表面活性剂家族中的后起之秀，它是由微生物所产生的一类具有表面活性的生物大分子物质。与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等相同作用外，还具有一般化学合成表面活性剂所不具备的无毒、能生物降解等优点。随着人们崇尚自然和环保意识的增强，生物表面活性剂将越来越受到人们的青睐，并有可能成为化学合成表面活性剂的替代品或升级换代品。鼠李糖脂是一种常见的生物表面活性剂，具有良好的溶解性及化学稳定性，被广泛的运用在各行各业。目前鼠李糖脂生产菌主要为铜绿假单菌和伯克氏菌。主要通过理化诱变及基因改造技术增强菌株的生产能力。在申请号201510078536.X的专利技术专利中介绍了一种通过基因工程手段构建了pa3286蛋白表达量增加的菌株，使假单胞菌合成鼠李糖脂的能力提高了50％。但是多数铜绿假单胞菌和伯克氏菌具有条件致病性的特点，由于菌株的致病因子和鼠李糖脂同受高丝酰胺内酯类群体感应系统所调控，在提高鼠李糖脂合成量的过程中，具有提高致病性的风险。因此，如何降低致病性、提高鼠李糖脂的新方法需要探寻。在铜绿假单胞菌体内，具有多个群体感应系统，其中lasIR系统调控很多致病因子的分泌。多数临床分离的铜绿假单胞菌群体感应lasR缺失突变株，其致病因子表达显著下降。使用铜绿假单胞菌lasR突变株用于鼠李糖脂的合成，具体提高所制备的鼠李糖脂生物安全性的优点。鼠李糖脂合成受rhlIR系统调控。环境因子可以影响rhlIR的表达，从而影响鼠李糖脂的合成量。一方面，铁限制培养条件可以显著提高rhlIR的表达；另一方面，纳米材料由于具有与宏观物质所迥异的表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应和量子限域效应，可对细菌的合成代谢产生特异性的影响。即可以形成促进鼠李糖脂的培养条件，进行其产量的提高。综上所述，运用致病能力较弱的缺失群体感应基因lasR的突变菌株，在适当的培养条件下以合适的纳米颗粒刺激鼠李糖脂的合成，这不仅能促进鼠李糖脂的分泌，而且大大降低了生产过程中的健康风险，还具有成本低、操作简单的特点。
技术实现思路
为解决现有技术中所存在的问题，本专利技术提供一种高效无害化的鼠李糖脂生物制备方法。一种发酵培养基，由PM培养基添加酪蛋白或谷氨酸组成，其中，所述发酵培养基中酪蛋白或谷氨酸的浓度为8～12g/L，Fe2+的浓度为2～3μM。进一步地，酪蛋白或谷氨酸的浓度为10g/L，Fe2+的浓度为2.5μM。PM培养基组成如下：c((NH4)2SO4)1g/L；c(KH2PO4)1.7g/L；c(NaHPO4)1.775g/L；c(EDTA)0.0025g/L；c(ZnSO4·7H2O)0.011g/L；c(MnSO4·H2O)0.00154g/L；c(CuSO4·5H2O)0.000392g/L；c(Co(NO3)2·6H2O)0.00025g/L；c(Na2B4O7·10H2O)0.000177g/L；c(CaCl2·2H2O)0.0667g/L；c(MgSO4)0.289g/L；c((NH4)6Mo7O24·4H2O)＝0.000185g/L；c(KOH)0.146g/L；c(氨三乙酸)0.2g/L；c(FeSO4·7H2O)以Fe2+的浓度为2～3μM进行添加。本专利技术还提供一种鼠李糖脂的生物制备方法，包括如下步骤：(1)将鼠李糖脂生产菌种子液接入本专利技术所述发酵培养基中，进行发酵培养；然后将纳米颗粒以10μg/L～5mg/L加入发酵培养基中；(2)步骤(1)所得发酵液进行分离提取，得鼠李糖脂。本专利技术中促进鼠李糖脂产生的培养基为铁限制培养基，铁限制条件可以提高rhlIR的表达，从而使鼠李糖脂的产生量显著提高。所用的纳米颗粒皆为常见的纳米颗粒，对微生物毒性作用不明显，但能促进鼠李糖脂的分泌。所用的提取鼠李糖脂的方法用酸沉淀冷冻干燥法代替常用的氯仿/甲醇萃取法，更为绿色环保。鼠李糖脂合成受rhlIR系统调控。环境因子可以影响rhlIR的表达，从而影响鼠李糖脂的合成量。一方面，铁限制培养条件可以显著提高rhlIR的表达；另一方面，纳米材料由于具有与宏观物质所迥异的表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应和量子限域效应，可对细菌的合成代谢产生特异性的影响。即两方面协同可以形成促进鼠李糖脂的培养条件，进行其产量的提高。本专利技术的发酵培养基及生物制备方法适用于所有的鼠李糖脂生产菌，本专利技术采用其中的集中进行实验并作了优化，优选采用铜绿假单胞菌野生株、缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株或洋葱伯克氏菌株，其中缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株的致病性小，是更好的选择。如使用缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株作为鼠李糖脂生产菌，大大减弱了铜绿假单胞菌与伯克氏菌所带来的致病性。在铜绿假单胞菌体内，具有多个群体感应系统，其中lasIR系统调控很多致病因子的分泌。多数临床分离的铜绿假单胞菌群体感应lasR缺失突变株，其致病因子表达显著下降。即使用铜绿假单胞菌lasR突变株用于鼠李糖脂的合成，具体提高所制备的鼠李糖脂生物安全性的优点。综上，如运用致病能力较弱的缺失群体感应基因lasR的突变菌株，在适当的培养条件下以合适的纳米颗粒刺激鼠李糖脂的合成，这不仅能促进鼠李糖脂的分泌，而且大大降低了生产过程中的健康风险，还具有成本低、操作简单的特点。铜绿假单胞菌野生株和洋葱伯克氏菌株采用常规分离方法自行分离即可。缺失lasR基因的铜绿假单胞菌突变株已在(ChuganiSA,WhiteleyM,LeeKM,etal.QscR,amodulatorofquorum-sensingsignalsynthesisandvirulenceinPseudomonasaeruginosa.[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,2001,98(5):2752-7.)中公开，本专利技术中，按照该文献所公开的方法采用现有分子生物学手段进行构建。本专利技术对鼠李糖脂合成的种子液培养时间进行优化，优选使用处于对数生长期或稳定期前期的种子液。本专利技术对促进鼠李糖脂产生的培养基进行优化，优选使用铁限制的培养基，进一步地，所述铁限制的培养基为铁限制谷氨酸培养基或铁限制酪蛋白培养基。优选地，所述纳米颗粒为纳米二氧化钛、碳纳米管或石墨烯，粒径≤50nm。进一步优选地，所述纳米颗粒的粒径≤50nm，纯度≥98％的二氧化钛颗粒。为使纳米颗粒能更好的分散在培养基中，优选地，所述纳米颗粒加入前超声分散在无离子水中，然后加入所述发酵培养基中。优选地，所述纳米颗粒在发酵培养基中的浓度为100μg/L～1mg/L。在最优培养条件下，加入此浓度范围的纳米本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵培养基，其特征在于，由PM培养基添加酪蛋白或谷氨酸组成，其中，所述发酵培养基中酪蛋白或谷氨酸的浓度为8～12g/L，Fe2+的浓度为2～3μM。

【技术特征摘要】
1.一种发酵培养基，其特征在于，由PM培养基添加酪蛋白或谷氨酸组成，其中，所述发酵培养基中酪蛋白或谷氨酸的浓度为8～12g/L，Fe2+的浓度为2～3μM。2.如权利要求1所述发酵培养基，其特征在于，酪蛋白或谷氨酸的浓度为10g/L，Fe2+的浓度为2.5μM。3.一种鼠李糖脂的生物制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将鼠李糖脂生产菌种子液接入如权利要求1所述发酵培养基中，进行发酵培养；然后将纳米颗粒以10μg/L～5mg/L加入发酵培养基中；(2)步骤(1)所得发酵液进行分离提取，得鼠李糖脂。4.根据权利要求3所述生物制备方法，其特征在于，种子液为处于对数生长期或稳定期前期的种子液。5.根据权利要求3...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪美贞，汪丽佳，严慧聪，沈臻，黄超民，张芸芸，陈健，李娜，申屠佳丽，殷峻，沈东升，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33