一种多通道荧光相关光谱的多聚体检测数据处理方法技术

本发明专利技术涉及一种多通道荧光相关光谱的多聚体检测数据处理方法，通过将脉冲激光器、多个单光子检测器、时间相关单光子计数器与共聚焦荧光显微镜联合，建立数学模型定量分析溶液中的聚集体浓度。该数据处理方法基于单分子荧光的反聚束效应(anti‑bunching)，即当激发脉冲的时间短于荧光分子中电子从第一电子激发态跃迁到基态所需的时间时，单个荧光分子在该脉冲下发射的光子数不可能大于一个，因此每个脉冲内检测到的光子数与共聚焦微区内的荧光分子数及聚集度密切相关。本发明专利技术通过记录一段时间内检测到的多光子流数据，统计单个脉冲、连续多个脉冲下不同光子数的概率，并构建与多聚体物种浓度相关的理论模型，从而定量获得多聚体系中各物种的浓度分布信息。

Data processing method for multi channel fluorescence correlation spectroscopy for multi polymer detection

The invention relates to a multi-channel fluorescence correlation spectroscopy multimeric detection data processing method by pulse laser, single photon detector, a time correlated single photon counting and confocal fluorescence microscopy, analysis of the establishment of body concentrations in the solution quantitative mathematical model. The data processing method of antibunching effect based on single molecule fluorescence (anti bunching), namely when the excitation pulse in a short time from the first electronic fluorescent molecular electronic excited state transitions to the ground state of the required time, photon emission of single fluorescent molecule in the pulse cannot be greater than one, so photon number and confocal in each pulse to detect micro fluorescent molecules within the area of the number and degree of aggregation is closely related. The invention can record a multiphoton time detection of the stream data, statistics, single pulse continuous multiple pulse under different photon probability, and construct the theoretical model with poly body species concentration, so as to obtain quantitative concentration distribution channel poly system in the interest of all species.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于荧光相关光谱领域，尤其涉及一种对多通道模式下得到的光子流数据进行分析的方法，最终得到多肽或蛋白质在溶液中聚集形成不同寡聚体的浓度分布。
技术介绍
目前，多肽或蛋白质在某些条件下从可溶性单体转变成高度有序的纤维状聚集体，这种转变往往导致神经退行性病变或系统性淀粉样变性。对蛋白质聚集过程的定量研究需要在不破坏结构的条件下明确和定量寡聚体物种及尺寸的变化，由于研究体系是一个多物种的动态变化过程，包括单体、不同聚集度的寡聚体、原纤维和纤维的相互转变，目前所用的检测技术大部分都不适用于浓度低于微摩尔级别的样品体系，而且很多都包含分离、样品前处理等步骤，从而破坏寡聚体聚集平衡、引入杂质。本专利技术所提出的方法，可以弥补现有方法的不足，有效地定量研究上述多肽聚集的动力学过程。荧光相关光谱能实现单分子检测，但在研究多肽聚集过程方面，传统的FCS、FCCS、PCH并不能够通过扩散系数的微小差异来区分单体与寡聚体。目前有报道用FRET-FCS、MEM-FCS等方法来实现有微小尺寸差异寡聚体的区分和定量。FRET-FCS研究中将两种荧光标记的多肽分子溶解于溶液体系，利用聚集时两个荧光团之间的FRET导致荧光强度的变化来区分聚集过程。而MEM拟合法得出的物种丰度呈高斯分布，不能够很精细的区分寡聚物物种。因此，本领域亟需发展一种数据分析方法，能够研究复杂生物体系例如多聚体系中各物种的含量及相互转化动力学信息。
技术实现思路
为解决现有技术中的问题，本专利技术基于多通道荧光相关光谱，即将脉冲激光器、八个单光子检测器、时间相关单光子计数器与共聚焦显微镜联合，检测多通道荧光相关光谱的多聚体系中各物种的浓度分布信息。本专利技术建立了基于单分子荧光反聚束效应的多聚体区分理论模型，主要是根据荧光标记多肽在溶液中自发聚集产生的聚集体在激光共聚焦区域被激发，因荧光分子光子反聚束效应，一个荧光分子只能一次性被激发产生一个光子，由此推导出荧光分子在单脉冲激发下发一个光子的概率公式，及多聚体在单脉冲下发出不同光子数的概率；然后通过借助Matlab编辑程序，模拟基于八通道的荧光相关光谱法一段时间内荧光标记多肽聚集体的发光情况，激发光为频率107Hz的脉冲激光；统计模拟时间内检测到光子数的频数分布，归一化到每个脉冲后即为发不同光子数概率，可以与不同聚集度的荧光标记寡聚体的浓度构建等式关系；此外连续两个脉冲检测到的光子数分布与多肽寡聚体的浓度分布也密切相关，也可以构建等式关系。由以上等式关系联立方程可以求解出寡聚体浓度。为达此目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种多通道荧光相关光谱的多聚体检测数据处理方法，其用于获取多聚体系中各物种的浓度分布信息，所述方法包括以下步骤：(1)从原始光子流数据中分别统计单脉冲发n个光子的频数分布Nn-raw、连续双脉冲第一个脉冲发i个光子，第二个脉冲发j个光子的频数分布Nij-raw；(2)将从原始光子流数据统计得到的频数分布作去检测器影响处理，得到单脉冲真实发光光子数频数分布Nn-true和连续双脉冲真实发光光子数频数分布Nij-true；(3)对真实发光光子数频数分布利用总累积测量时间t和激发光频率f进行归一化计算，得到单脉冲发光概率pn-pulse和双脉冲发光概率pij-pulse；(4)求解单脉冲发光概率pn-pulse和双脉冲发光概率pij-pulse与多聚体物种浓度c联立所得方程组，从而获得多聚体系中各物种的浓度分布信息。本专利技术中，步骤(2)中所述去检测器影响处理是指分别计算多个光子同时进入同一检测器的概率，并根据此概率对由原始光子流数据统计得到的光子频数分布Nn-raw进行校正。本专利技术之所以作去检测器影响处理，其主要是由于单光子检测器的死时间影响，当多于一个的光子进入同一通道时，每个检测器单个脉冲内只能检测到最先到达的光子，因此检测器检测到的光子个数信息存在偏差，因此为了得到更准确的信息，需要进行上述去检测器影响处理。根据本专利技术，在激光共聚焦区域内，一个荧光分子在共聚焦微区点(x,y,z)处的发光概率I(x,y,z)为：荧光分子在样品体系中的平均发光概率Imean为：其中wxy和wz是共聚焦体系点扩散函数中x-y平面和z轴向半径，V为溶液样品的体积，V0为共聚焦体积；I0＝ρ0σQη，ρ0为共聚焦中心处的光子密度，σ为分子吸收截面积，Q为荧光量子产率，η为包含物镜效率、检测器效率和光学元件效率的检测效率。本专利技术中，步骤(1)是采用分子动力学模拟荧光标记多聚体在溶液中扩散并被激发发射荧光光子的过程，并模拟八通道单光子计数器生成光子数据流，统计得到单脉冲下发光光子数频数分布Nn-raw和双脉冲下发光光子数频数分布Nij-raw。根据本专利技术，在步骤(2)中，由于单光子检测器的死时间影响，当多于一个的光子进入同一通道时，每个检测器单个脉冲内只能检测到一个光子，因此检测器检测到的光子个数信息存在偏差，需要作去检测器影响处理，即检测到的单脉冲下发光光子数频数分布Nn-raw与共聚焦区域内的荧光分子实际发出的单脉冲真实发光光子数频数分布Nn-true有如下校正关系：其中为第二类stirling函数，符号A和C分别表示数学上的排列和组合，由式(3)推导出去检测器影响后的单脉冲真实发光光子数频数分布Nn-true为：连续双脉冲下发光光子数频数分布Nij-raw与连续双脉冲真实发光光子数频数分布Nij-true分别由单脉冲下发光光子数频数分布Nn-raw和单脉冲真实发光光子数频数分布Nn-true统计得到。本专利技术的步骤(3)中，将得到的真实发光光子数频数分布进行如下归一化计算，得到单脉冲发光概率pn-pulse和双脉冲发光概率pij-pulse；其中t为分子动力学模拟光子流数据总累积时间，f为激发光频率。根据式(1)将单脉冲激发下每个荧光分子的发光情况按遍历法计算pn-pulse概率分布，用(1-I(x,y,z))表示处于空间位置(x,y,z)处的荧光分子不发光的概率，空间坐标(x,y,z)的下标数字及字母j、k、l用来区分不同位置的荧光分子，M表示荧光分子总数：观察式(7)的规律，对其作如下变换：为方便表述，将式(8)中等号左边用pn′代替：根据本专利技术，对于二聚体系，单脉冲下发光概率的分布情况具体表述为：其中pA1表示由单体发出一个光子的概率，pB1表示由二聚体发出一个光子的概率，pB2表示由单个二聚体发出两个光子的概率；根据式(1)(2)得到下式：其中nA、nB表示样品体系中单体和二聚体的分子总个数，SA、SB分别表示共聚焦微区中单体和二聚体的分子个数，SA＝nAV0/V，SB＝nBV0/V；根据式(10)(11)得到下式：对于连续双脉冲，连续双脉冲中第一个脉冲发一个光子、第二个脉冲不发光子的概率p10-pulse表述为：其中，p00-pulse是连续双脉冲不发光的概率，联立式(12)(13)求解出未知数SA、SB和I0，聚集体浓度CA、CB便由下式得出：其中NA为阿伏伽德罗常数。根据本专利技术，对于四聚体系，单脉冲下发光概率的分布情况表述为：其中A，B，C，D分别表示一至四聚体，(pA1+pB1+pC1+pD1)表示由单体、二聚体、三聚体或四聚体发出一个光子的概率，(pB2+pC2+pD2)表示由单个二聚体、三聚体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多通道荧光相关光谱的多聚体检测数据处理方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)从原始光子流数据中分别统计单脉冲发n个光子的频数分布Nn‑raw、连续双脉冲第一个脉冲发i个光子，第二个脉冲发j个光子的频数分布Nij‑raw；(2)将从原始光子流数据统计得到的频数分布作去检测器影响处理，得到单脉冲真实发光光子数频数分布Nn‑true和连续双脉冲真实发光光子数频数分布Nij‑true；(3)对真实发光光子数频数分布利用总累积测量时间t和激发光频率f进行归一化计算，得到单脉冲发光概率pn‑pulse和双脉冲发光概率pij‑pulse；(4)求解单脉冲发光概率pn‑pulse和双脉冲发光概率pij‑pulse与多聚体物种浓度c联立所得方程组，从而获得多聚体系中各物种的浓度分布信息。

【技术特征摘要】
1.一种多通道荧光相关光谱的多聚体检测数据处理方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)从原始光子流数据中分别统计单脉冲发n个光子的频数分布Nn-raw、连续双脉冲第一个脉冲发i个光子，第二个脉冲发j个光子的频数分布Nij-raw；(2)将从原始光子流数据统计得到的频数分布作去检测器影响处理，得到单脉冲真实发光光子数频数分布Nn-true和连续双脉冲真实发光光子数频数分布Nij-true；(3)对真实发光光子数频数分布利用总累积测量时间t和激发光频率f进行归一化计算，得到单脉冲发光概率pn-pulse和双脉冲发光概率pij-pulse；(4)求解单脉冲发光概率pn-pulse和双脉冲发光概率pij-pulse与多聚体物种浓度c联立所得方程组，从而获得多聚体系中各物种的浓度分布信息。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在激光共聚焦区域内，一个荧光分子在共聚焦微区点(x,y,z)处的发光概率I(x,y,z)为：I(x,y,z)=I0exp(-2(x2+y2)/wxy2-2z2/wz2)---(1)]]>荧光分子在样品体系中的平均发光概率Imean为：Imean=∫∫∫I(x,y,z)dxdydzV=I0(π2)3wxy2wzV=I0V0V---(2)]]>其中wxy和wz是共聚焦体系点扩散函数中x-y平面和z轴向半径，V为溶液样品的体积，V0为共聚焦体积；I0＝ρ0σQη，ρ0为共聚焦中心处的光子密度，σ为分子吸收截面积，Q为荧光量子产率，η为包含物镜效率、检测器效率和光学元件效率的检测效率。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用分子动力学模拟荧光标记多聚体在溶液中扩散并被激发发射荧光光子的过程，并模拟八通道单光子计数器生成光子数据流，统计得到单脉冲下发光光子数频数分布Nn-raw和双脉冲下发光光子数频数分布Nij-raw。4.如权利要求1-3之一所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，由于单光子检测器的死时间影响，当多于一个的光子进入同一通道时，每个检测器单个脉冲内只能检测到一个光子，因此检测器检测到的光子个数信息存在偏差，需要作去检测器影响处理，即检测到的单脉冲下发光光子数频数分布Nn-raw与共聚焦区域内的荧光分子实际发出的单脉冲真实发光光子数频数分布Nn-true有如下校正关系：N1-raw=A81S(1,1)81N1-true+A81S(2,1)82N2-true+A81S(3,1)83N3-true+...N2-raw=A82S(2,2)82N2-true+A82S(3,2)83N3-true+A82S(4,2)84N4-true+...N3-raw=A83S(3,3)83N3-true+A83S(4,3)84N4-true+A83S(5,3)85N5-true+......Nn-raw=Σi=n∞A8nS(i,n)8iNi-true---(3)]]>其中为第二类stirling函数，符号A和C分别表示数学上的排列和组合，由式(3)推导出去检测器影响后的单脉冲真实发光光子数频数分布Nn-true为：N1-true=N1-raw-17N2-raw+121N3-raw-135N4-raw...N2-true=87N2-raw-47N3-raw+44105N4-raw...N3-true=3221N3-raw-6435N4-raw...N4-true=256105N4-raw......---(4)]]>连续双脉冲下发光光子数频数分布Nij-raw与连续双脉冲真实发光光子数频数分布Nij-true分别由单脉冲下发光光子数频数分布Nn-raw和单脉冲真实发光光子数频数分布Nn-true统计得到。5.如权利要求1-4之一所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，将得到的真实发光光子数频数分布进行如下归一化计算，得到单脉冲发光概率pn-pulse和双脉冲发光概率pij-pulse；pn-pulse=Nn-truetf---(5)]]>pij-pulse=Nij-truetf-1---(6)]]>其中t为分子动力学模拟光子流数据总累积时间，f为激发光频率。6.如权利要求2-5之一所述的方法，其特征在于，根据式(1)将单脉冲激发下每个荧光分子的发光情况按遍历法计算pn-pulse概率分布，用(1-I(x,y,z))表示处于空间位置(x,y,z)处的荧光分子不发光的概率，空间坐标(x,y,z)的下标数字及字母j、k、l用来区分不同位置的荧光分子，M表示荧光分子总数：p1-pulse=1VΣj=1M∫∫∫I(xj,yj,zj)(1-I(xj,yj,zj))(1-I(x1,y1,z1))(1-I(x2,y2,z2))...(1-I(xN,yN,zN))dx1dy1dz1...dxNdyNdzN=C11VΣj=1M∫∫∫I(xj,yj,zj)dxdydz-C212!VΣj≠kΣ∫∫∫I(xjyj,zj)I(xk,yk,zk)dxdydz+C313!VΣj≠k≠lΣΣ∫∫∫I(xj,yj,zj)I(xk,yk,zk)I(xl,yl,zl)dxdydz-C414!VΣj≠k≠l≠mΣΣΣ∫∫∫I(xj,yj,zj)I(xk,yk,zk)I(xl,yl,zl)I(xm,ym,zm)dxdydz+...p2-pulse=1VΣj≠k=1M∫∫∫I(xj,yj,zj)I(xk,yk,zk)(1-I(xj,yj,zj))(1-I(xk,yk,zk))(1-I(x1,y1,z1))(1-I(x2,y2,z2))...(1-I(xN,yN,zN))dx1dy1dz1...dxNdyNdzN=C222!VΣj≠kΣ∫∫∫I(xj,yj,zj)I(xkyk,zk)dxdydz-C323!VΣj≠k≠lΣΣ∫∫∫I(xj,yj,zj)I(xk,yk,zk)I(xl,yl,zl)dxdydz+C424!VΣj≠k≠l≠mΣΣΣ∫∫∫I(xj,yj,zj)I(xk,yk,zk)I(xl,yl,zl)I(xm,ym,zm)dxdydz-...p3-pulse=C333!VΣj≠k≠lΣΣ∫∫∫I(xj,yj,zj)I(xk,yk,zk)I(xl,yl,zl)dxdydz-C444!VΣj≠k≠l≠mΣΣΣ∫∫∫I(xj,yj,zj)I(xk,yk,zk)I(xl,yl,zl)I(xm,ym,zm)dxdydz+...p4-pulse=C444!VΣj≠k≠l≠mΣΣΣ∫∫∫I(xj,yj,zj)I(xk,yk,zk)I(xl,yl,zl)I(xm,ym,zm)dxdydz-......---(7)]]>观察式(7)的规律，对其作如下变换：1VΣj=1M∫∫∫I(xj,yj,zj)dxdydz=Σi...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢黎明，李瑞如，高珊珊，崔孟华，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：北京;11