利用根癌土壤杆菌生物合成纳米硒的方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种利用无致病性的根癌土壤杆菌生物合成纳米硒的方法及其应用。本发明专利技术从土壤中分离得到一株可耐受较高浓度亚硒酸盐、硒酸盐的根癌土壤杆菌S2‑323，利用菌株S2‑323合成生物纳米硒，对生物纳米硒进行分离纯化，大量制备生物纳米硒，并在肥料、饲料、富硒功能食品加工、保健品及医药产品中应用。采用生物发酵工艺制备纳米硒，具有环境友好，产率高，安全高效等特点，生产获得的生物纳米硒用于富硒肥料、富硒饲料，施肥或饲喂后，作物、瓜果、蔬菜、肉蛋奶富硒效果显著。

Method for preparing nano selenium by Agrobacterium tumefaciens and application thereof

The invention provides a method for preparing nano selenium by using no pathogenic Agrobacterium tumefaciens and application thereof. The invention has been isolated from soil plant can tolerate high concentration of selenite and selenate by Agrobacterium tumefaciens S2 strain S2 323, using 323 synthetic bio nano selenium, selenium nanoparticles on biological purification, mass preparation of bio nano selenium, and the application of fertilizer, feed, food processing function of selenium health care products, and pharmaceutical products. The preparation of nano selenium by bio fermentation process, environmentally friendly, high yield, safe and efficient characteristics, production of bio nano selenium was used for selenium, selenium feed, fertilizer or feed, crops, fruits, vegetables, meat and milk selenium effect.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物学及生物纳米硒制备
，具体地说，涉及一种利用无致病性的根癌土壤杆菌生物合成纳米硒的方法及其应用。
技术介绍
硒(Selenium,Se)元素是许多有机体必需的微量元素之一，是生物体内硫氧还原蛋白酶、脱碘酶、谷胱甘肽过氧化酶等多种含硒酶蛋白的必需组分，并且参与人体多种代谢途径。研究发现，人体缺硒会导致多种疾病，并且增加患癌风险。我国具有丰富硒资源，但硒在自然界分布极不均匀，导致我国三分之二以上地区缺硒。中国营养学会及FAO/WHO/IAEA联合专家委员会确定人体硒摄入量适宜范围为60-250μg/d，安全剂量为400μg/d，中毒剂量为800μg/d。硒过量也会造成人体危害。因此亟待为缺硒人群开发安全高效硒源。自然界中硒形态包括负二价、零价、四价及六价四种形态，研究表明，负二价、四价及六价形态的硒毒性巨大，作为补硒源具有潜在危险；块状零价单质硒不具有生物学活性，而纳米级别的单质硒具有显著生物学活性，并且能显著抑制肿瘤，因此开发纳米硒作为补硒源具有明显优势。国内外研究人员对微生物参与的硒的各价态间的转化及有机硒的形成有较明确的认识。相对于化学或物理方法制备单质纳米硒过程中的高能耗高污染，通过微生物对无机硒转化，可得到更为简便、经济、绿色环保获取单质纳米硒的方法。近十年来，发现许多细菌可以耐受高浓度的硒盐，并转化硒盐为低毒的红色单质纳米硒。涵盖的种属极其丰富，已有报道约30个属，包括大肠杆菌(Escherichiacoli)、荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)等，总体上它们属于变形菌门和厚壁菌门。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用根癌土壤杆菌生物合成纳米硒的方法及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术从土壤中分离得到一株可耐受较高浓度亚硒酸盐、硒酸盐的根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)S2-323，菌株S2-323现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCCNo.12580，保藏日期2016年6月1日。根癌土壤杆菌S2-323为土壤杆菌属，根癌土壤杆菌属于变形菌门、根瘤菌科，革兰氏阴性杆菌，主要分布于根际土壤中，为植物内生菌，多数菌株能在低氧张力的植物组织中生长。本专利技术还提供含有所述根癌土壤杆菌S2-323的复合微生物菌剂。本专利技术还提供利用所述根癌土壤杆菌S2-323生物合成纳米硒的方法，所述方法是向发酵培养基中添加亚硒酸盐和/或硒酸盐，发酵培养根癌土壤杆菌S2-323，并从发酵产物中分离纯化纳米硒。所述发酵产物包括发酵液经离心所得菌体沉淀，菌悬液以及菌体裂解液。本专利技术所述亚硒酸盐、硒酸盐包括亚硒酸/硒酸的钠盐、钾盐等无机盐。优选亚硒酸钠、硒酸钠。所述发酵培养基中亚硒酸盐的浓度为0.001-100mM，优选1-5mM，更优选5mM。所述发酵培养基中硒酸盐的浓度为0.001-500mM，优选0.001-400mM，更优选0.001-300mM。本专利技术提供的利用根癌土壤杆菌S2-323生物合成纳米硒的方法，包括以下步骤：S1、菌种活化用NA培养基对菌株进行活化培养，NA培养基配方为：牛肉膏30g/L，蛋白胨5g/L，MnSO4·H2O5mg/L，琼脂15g/L，pH7.0-7.2；将菌株S2-323接种于NA培养基斜面上，28℃培养36小时；S2、种子液的制备种子培养用GYT液体培养基，GYT液体培养基配方为：蔗糖10-12g/L，酵母膏8-10g/L，KH2PO42.0-4.0g/L，NaCl0.2-0.4g/L，MgSO4·7H2O0.3-0.5g/L，pH7.0-7.2；将活化好的菌株S2-323用无菌生理盐水配制成108CFU/mL的菌悬液，以1％的接种量接种于GYT液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为150rpm，培养时间为24-36h；S3、发酵罐发酵发酵培养采用CM发酵培养基，CM发酵培养基配方为：蛋白胨5-8g/L，葡萄糖10-15g/L，玉米粉5-15g/L，亚硒酸盐5mM，pH7.2；控制培养基体积为发酵罐体积的50-70％，将种子液按照1-3％的接种量接入发酵罐，控制发酵温度为25-30℃，搅拌速度为200-300rpm，通气量为1：0.8-1.2(发酵液体积：每分钟通气量体积)，罐压1.2-1.6F/cm2，发酵48-96小时；S4、从发酵产物中分离纯化纳米硒。从发酵产物中分离纯化生物纳米硒的方法如下：方案I：发酵液下罐，5000-9000rpm离心15-30min收集菌体沉淀，用无菌生理盐水5000-9000rpm离心15-30min清洗2-3遍，并用发酵液1/20体积的水(优选无菌纯净水)重悬沉淀，所得菌悬液经冷冻干燥，即得纳米硒干粉。方案II：a、发酵液下罐，将发酵液置于冰上进行超声破碎细胞，设置变幅杆为Φ8-12，占空比30-60％，功率600-700W，频率20KHz，启停间隔5-10s，破碎15-40min，得到菌体裂解液；b、菌体裂解液于4000-8000rpm离心10-25min，所得沉淀用无菌生理盐水4000-8000rpm离心20-30min清洗2-3遍；将沉淀重悬于发酵液1/20体积的水(优选无菌纯净水)中，得到纳米硒悬液；c、将纳米硒悬液转移至萃取塔中，按照发酵液0.3-0.6倍体积的量加入环己烷萃取3-5次，收集下层水相，4000-6000rpm离心10-25min，所得沉淀用无菌生理盐水5000-8000rpm离心10-20min清洗2-3遍；冷冻干燥，即得纳米硒干粉；d、获得高纯度、分散性较好生物纳米硒悬液。冷冻干燥与生物纳米硒制备：将方案I中制备的生物纳米硒，用液氮冷冻20-30min，放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷冻干燥参数为压强30-200Pa，加热板温度为28-37℃，样品厚度为15-30mm；干燥时间在60-80小时，得到生物纳米硒干粉A。将方案II中制备的生物纳米硒，用液氮冷冻20-30min，放入冷冻干燥机中进行冷冻干燥，冷冻干燥参数为压强20-80Pa，加热板温度为5-15℃，样品厚度为5-10mm；干燥时间在24-48小时，得到纯生物纳米硒干粉B。本专利技术还提供由所述根癌土壤杆菌S2-323发酵制备的生物纳米硒。其中，所述生物纳米硒的粒径为100-300nm，主要粒径为200-250nm。本专利技术进一步提供由所述根癌土壤杆菌S2-323生物合成的纳米硒在制备食品、保健品、药品、畜禽饲料以及农用肥料中的应用。本专利技术还提供由所述生物纳米硒制备的富硒功能食品、富硒保健品和硒药片以及富硒肥料、富硒饲料。其中，生物纳米硒所占含量分别为10-2500μg/kg、10-500mg/kg、50-800mg/kg、50-800μg/kg和1-5g/kg。在本专利技术的一个具体实施方式中，将生物纳米硒干粉A和B分别悬浮于纯净水中，配制成1-5g/L的富硒肥料A和富硒肥料B。将肥料A和B用于小麦、水稻、玉本文档来自技高网...

【技术保护点】
根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)S2‑323，其保藏编号为CGMCC No.12580。

【技术特征摘要】
1.根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)S2-323，其保藏编号为CGMCCNo.12580。2.含有权利要求1所述根癌土壤杆菌S2-323的复合微生物菌剂。3.利用权利要求1所述根癌土壤杆菌S2-323生物合成纳米硒的方法，其特征在于，向发酵培养基中添加亚硒酸盐和/或硒酸盐，发酵培养根癌土壤杆菌S2-323，并从发酵产物中分离纯化纳米硒。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中亚硒酸盐的浓度为0.001-100mM，优选1-5mM，更优选5mM；所述发酵培养基中硒酸盐的浓度为0.001-500mM，优选0.001-400mM，更优选0.001-300mM。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、菌种活化用NA培养基对菌株进行活化培养，NA培养基配方为：牛肉膏30g/L，蛋白胨5g/L，MnSO4·H2O5mg/L，琼脂15g/L，pH7.0-7.2；将菌株S2-323接种于NA培养基斜面上，28℃培养36小时；S2、种子液的制备种子培养用GYT液体培养基，GYT液体培养基配方为：蔗糖10-12g/L，酵母膏8-10g/L，KH2PO42.0-4.0g/L，NaCl0.2-0.4g/L，MgSO4·7H2O0.3-0.5g/L，pH7.0-7.2；将活化好的菌株S2-323用无菌生理盐水配制成108CFU/mL的菌悬液，以1％的接种量接种于GYT液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为150rpm，培养时间为24-36h；S3、发酵罐发酵发酵培养采用CM发酵培养基，CM发酵培养基配方为：蛋白胨5-8g/L，葡萄糖10-15g/L，玉米粉5-15g/L，亚硒酸盐5mM，pH7.2；控制培养基体积为发酵罐体积的50-70％，将种子液按照1-3％的接种量接入发酵罐，控制发酵温度为25-30℃，搅拌速度为...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭岩彬，李奎，陈志蓥，赵桂慎，吴文良，李柯，谢斌，王浩阳，方勇，胡秋辉，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11