一种生产甘草次酸或其前体物的酿酒酵母工程菌及构建方法技术

本发明专利技术公开一种生产甘草次酸或其前体物：11‑羟基‑β‑香树脂醇，或11‑氧‑β‑香树脂醇，或30‑羟基‑β‑香树脂醇，或11，30‑羟基‑β‑香树脂醇，或30‑羟基‑11‑氧‑β‑香树脂醇，或30‑醛基‑11‑氧‑β‑香树脂醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法，其生产步骤为分别构建β‑香树脂醇合酶表达盒、β‑香树脂醇的碳11位的氧化酶表达盒、11‑氧‑β‑香树脂醇的碳30位的氧化酶表达盒、细胞色素P450氧化还原酶表达盒，并共同导入酿酒酵母基因组中。本发明专利技术将甘草次酸的合成与酵母的生长耦合，实现了甘草次酸或其前体物的酵母合成，该方法不需要效应剂的诱导、工艺简单，可用于发酵生产甘草次酸及其关键前体物。

Saccharomyces cerevisiae engineering bacterium for producing glycyrrhetinic acid or its precursor and construction method thereof

The invention discloses a production of glycyrrhetinic acid or its precursor: 11 hydroxy beta amyrin, or 11 oxygen beta amyrin, or 30 hydroxy beta amyrin, or 11, 30 hydroxy beta amyrin, or 30 hydroxy 11 oxygen beta amyrin, Saccharomyces cerevisiae or 30 aldehyde 11 oxygen beta amyrin and its construction method, its production process is constructed beta amyrin synthase expression cassette, beta oxidase amyrin carbon 11 expression cassettes 11, oxygen oxidase beta amyrin carbon 30 expression cassettes, cytochrome P450 reductase expression cassette, and into the genome of Saccharomyces cerevisiae. The coupled growth of yeast and synthesis of glycyrrhetinic acid, the yeast synthesis of glycyrrhetinic acid or its precursors, the method does not require induction, process effect agent simple, can be used for the fermentation of glycyrrhetinic acid and its key precursors.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种酿酒酵母工程菌的构建及发酵生产甘草次酸或其前体物：11-羟基-β-香树脂醇(11-hydroxy-β-amyrin)，或11-氧-β-香树脂醇(11-oxo-β-amyrin)，或30-羟基-β-香树脂醇(30-hydroxy-β-amyrin)，或11,30-羟基-β-香树脂醇(11,30-hydroxy-β-amyrin)，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇(30-hydroxy-11-oxo-β-amyrin)，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇(Glycyrrhetaldehyde)的方法，属于生物工程领域。
技术介绍
萜类物质是植物次生代谢产物的一种，具有多种多样的生物活性与药理价值。药理学已经证明三萜类化合物如甘草酸(Glycyrrhizin，GL)在保肝、抗炎症、抗肿瘤、抗病毒等方面具有非常重要的作用，同时也可作为甜味剂或食品添加剂。甘草次酸(Glycyrrhetinicacid，GA)是甘草酸合成的前体物质，与甘草酸相比，甘草次酸缺少2分子的葡萄糖醛酸基，所以极性较弱，较容易穿透细胞膜，且保留了与甘草酸一致的生理活性与功能，更容易在细胞内发挥其生物活性与功能。在植物甘草中，甘草次酸的含量极低，主要以甘草酸形式存在。植物提取存在周期长、效率低、成本高、环境破坏大等缺点。甘草次酸复杂的分子结构、严苛的合成条件也使其化学合成难以进行。随着合成生物学的发展，利用微生物合成甘草次酸等具有重大医药价值的化合物已成为一种发展趋势。微生物合成具有周期短，产量高，条件温和，过程可控等特点，因此可以有效缓解对植物资源的依赖，从而具有较高的经济效益与社会价值。在酿酒酵母工程菌中，甘草次酸或其前体物11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇的合成是经甲羟戊酸途径合成鲨烯，然后经2,3-氧化鲨烯单氧酶、β-香树脂醇合酶催化形成β-香树脂醇。本研究是在此基础上，进一步挖掘发现β-香树脂醇到甘草次酸的合成是由两个氧化酶CYP88D6和CYP72A154(或CYP72A63)顺序共同催化完成，微生物内并未发现这两种酶，因此，需要引入植物甘草中的两个酶在酿酒酵母体内进行表达，从而实现甘草次酸的生物合成。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶基因。本专利技术的第二个目的是提供一种氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶基因编码的蛋白质。本专利技术的第三个目的是提供一种细胞色素P450氧化还原酶基因。本专利技术的第四个目的是提供一种细胞色素P450氧化还原酶基因编码的蛋白质。本专利技术的第五个目的是提供一种生产甘草次酸或其前体物11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇的酵母菌的构建方法。本专利技术的第六个目的是提供一种利用生产甘草次酸或其前体物11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇的酵母菌的构建方法构建的酿酒酵母工程菌。本专利技术的技术方案概述如下：一种氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶基因，它是序列表中SEQIDNo.5所述的核苷酸序列。一种氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶基因编码的蛋白质，它是序列表SEQIDNo.6所述的氨基酸序列。一种细胞色素P450氧化还原酶基因，它是序列表中SEQIDNo.11所述的核苷酸序列。一种细胞色素P450氧化还原酶基因编码的蛋白质，它是序列表SEQIDNo.12所述的氨基酸序列。一种生产甘草次酸或其前体物11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：(1)β-香树脂醇合酶表达盒的构建：将左同源臂、酵母启动子、β-香树脂醇合酶、酵母终止子应用重叠延伸PCR的方法连接，得到β-香树脂醇合酶的表达盒；(2)氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶(I)表达盒的构建：将酵母启动子、氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶(I)、酵母终止子应用重叠延伸PCR的方法连接，得到氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶的表达盒。(3)氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶(II)表达盒的构建：将酵母启动子、氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶(II)、酵母终止子应用重叠延伸PCR的方法连接，得到氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶的表达盒。(4)细胞色素P450氧化还原酶表达盒的构建将酵母启动子、细胞色素P450氧化还原酶、酵母终止子应用重叠延伸PCR的方法连接，得到细胞色素P450氧化还原酶的表达盒。(5)筛选标记表达盒的构建将酵母终止子TPGK1、遗传霉素表达盒基因PTEF1-kanMX-TTEF1、右同源臂HOR应用重叠延伸PCR的方法以此连接，得到筛选标记表达盒。(6)将上述β-香树脂醇合酶表达盒，和/或氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶(I)表达盒，和/或氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶(II)表达盒，和/或细胞色素P450氧化还原酶表达盒插入到酿酒酵母INVSc1，或W303a，或W303ɑ，或BJ2168，或BY4742，或BY4700，或CEN.PK2-1C，或CEN.PK2-1D基因组整合位点中，得到生产甘草次酸或其前体物：11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇的酿酒酵母工程菌。所述酵母启动子为GPDp，和/或PGK1p，和/或TDH1p，和/或TEF1p，和/或ADH1p，和/或PGI1p，和/或TDH2p，和/或HXT2p，和/或HXT7p，和/或TEF2p，和/或PYK1p，和/或ENO2p，和/或PDC1p，和/或FBA1p，和/或GPM1p，和/或TPI1p，和/或GAL7p，和/或GAL1p，和/或GAL10p。所述酵母终止子为TDH3t，和/或PGK1t，和/或TDH1t，和/或TEF1t，和/或ADH1t，和/或PGI1t，和/或TDH2t，和/或HXT2t，和/或HXT7t，和/或TEF2t，和/或PYK1t，和/或ENO2t，和/或PDC1t，和/或FBA1t，和/或GPM1，和/或CYC1t，和/或TPI1t。所述基因组整合位点为HO位点，和/或YPRCtau3位点，和/或URA3位点，和/或TRP1位点，和/或LEU2位点，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种CYP450氧化酶，其氨基酸序列为SEQ ID No.6所示。

【技术特征摘要】
1.一种CYP450氧化酶，其氨基酸序列为SEQIDNo.6所示。2.编码权利要求1所述的CYP450氧化酶的基因片段。3.根据权利要求2所述的基因片段，其核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。4.一种细胞色素P450氧化还原酶，其氨基酸序列为SEQIDNo.12所示。5.编码权利要求4所述的细胞色素P450氧化还原酶的基因片段。6.根据权利要求5所述的基因片段，其核苷酸序列如SEQIDNo.11所示。7.一种生产甘草次酸或其前体物：11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征是包括如下步骤：(1)β-香树脂醇合酶表达盒的构建：将左侧同源臂，酵母启动子、β-香树脂醇合酶、酵母终止子应用重叠延伸PCR的方法连接，得到β-香树脂醇合酶的表达盒；(2)氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶(I)表达盒的构建：将酵母启动子、氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶、酵母终止子应用重叠延伸PCR的方法连接，得到氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶的表达盒。(3)氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶(II)表达盒的构建：将酵母启动子、氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶、酵母终止子应用重叠延伸PCR的方法连接，得到氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶的表达盒。(4)细胞色素P450氧化还原酶表达盒的构建：将酵母启动子、细胞色素P450氧化还原酶、酵母终止子应用重叠延伸PCR的方法连接，得到细胞色素P450氧化还原酶的表达盒。(5)将上述β-香树脂醇合酶表达盒，和/或氧化β-香树脂醇的碳11位的CYP450氧化酶(I)表达盒，和/或氧化11-氧-β-香树脂醇的碳30位的CYP450氧化酶(II)表达盒，和/或细胞色素P450氧化还原酶表达盒插入到酿酒酵母INVSc1，或W303a，或W303ɑ，或BJ2168，或BY4742，或BY4700，或CEN.PK2-1C，或CEN.PK2-1D基因组整合位点中，得到生产甘草次酸或其前体物：11-羟基-β-香树脂醇(11-hydroxy-β-amyrin)，或11-氧-β-香树脂醇(11-oxo-β-amyrin)，或30-羟基-β-香树脂醇(30-hydroxy-β-amyrin)，或11,30-羟基-β-香树脂醇(11,30-hydroxy-β-amyrin)，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇(30-hydroxy-11-oxo-β-amyrin)，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇(Glycyrrhetaldehyde)的酿酒酵母工程菌。8.根据权利要求7所述的一种生产甘草次酸或其前体物：11-羟基-β-香树脂醇或11-氧-β-香树脂醇或30-羟基-β-香树脂醇或11,30-羟基-β-香树脂醇或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征是所述酵母启动子为GPDp，和/或PGK1p，和/或TDH1p，和/或TEF1p，和/或ADH1p，和/或PGI1p，和/或TDH2p，和/或HXT2p，和/或HXT7p，和/或TEF2p，和/或PYK1p，和/或ENO2p，和/或PDC1p，和/或FBA1p，和/或GPM1p，和/或TPI1p，和/或GAL7p，和/或GAL1p，和/或GAL10p。9.根据权利要求7所述的一种生产甘草次酸或其前体物：11-羟基-β-香树脂醇，或11-氧-β-香树脂醇，或30-羟基-β-香树脂醇，或11,30-羟基-β-香树脂醇，或30-羟基-11-氧-β-香树脂醇，或30-醛基-11-氧-β-香树脂醇的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征是所述酵母终止子为TDH3t，和/或PGK1t，和/或TDH1t，和/或TEF...

【专利技术属性】
技术研发人员：李春，朱明，王彩霞，孙文涛，周安琪，
申请(专利权)人：北京理工大学，
类型：发明
国别省市：北京;11