一种基于SPR技术的可卡因检测方法技术

本发明专利技术公开一种基于SPR技术的可卡因检测方法。该方法是将SPR芯片经EDC/NHS活化后的羧基基团偶联BSA上的氨基后作为传感芯片，当待测样品通过传感芯片表面时，利用表面等离子体共振检测仪检测待检测唾液与分子识别敏感芯片界面处全反射光的光强变化来直接测定唾液中的可卡因含量。本发明专利技术方法检测灵敏度高，大大降低吸毒人员检测的漏检率，提高工作效率，具有重要的应用价值。

A method of cocaine detection based on SPR Technology

The invention discloses a method for detecting cocaine based on SPR technology. This method is the SPR chip by BSA EDC/NHS coupling after activation of carboxyl groups on the amino as the sensing chip, when the sample to be measured by the sensor chip surface when the light intensity change detection using surface plasmon resonance detector for interface detection in saliva and molecular recognition sensitive chip total reflection light to direct determination of cocaine content in saliva. The method of the invention has the advantages of high detection sensitivity, greatly reducing the detection rate of drug addicts and improving the work efficiency, and has important application value.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于毒品检测领域，涉及一种基于SPR技术的可卡因检测方法。
技术介绍
可卡因是从古柯叶中提取的一种白色晶状的生物碱,可卡因的化学结构是甲基芽子碱与苯甲酸形成的酯。可卡因盐酸在医学上常被用作局部麻醉剂。它与鸦片,吗啡不同的是,它是强效的中枢神经兴奋剂和局部麻醉剂。当地居民嚼食这种植物的叶子,能起到消除疲劳、提高情绪的作用。它能阻断人体神经传导,产生局部麻醉作用,并可通过加强人体内化学物质的活性刺激大脑皮层,兴奋中枢神经,表现出情绪高涨、好动、甚而会有攻击倾向,短期使用就会产生毒瘾。尽管已有化学法、色谱法、光谱法、免疫法、毛细管电泳法和离子迁移谱法等方法应用到毒品检测中，但化学法灵敏度低，色谱法、毛细管电泳法和离子迁移谱法前处理过程时间较长，需要专门技术人员和大规模昂贵仪器，光谱法灵敏度低以及对待测样品纯度要求较高，免疫法操作时间过长。目前应用于吸毒检测中最广泛的为胶体金试纸，但其以吸毒人员尿液为检测对象，且其灵敏度只有300-1000ng/ml。而本技术以其高灵敏度，可实现对吸毒人员的唾液中毒品进行检测，从而避免了对客体隐私的侵犯，并大大提高了工作效率。表面等离子体共振(SurfacePlasmonResonance,SPR)技术是基于物理光学现象的一种分析技术。当偏振光以共振角入射照在金属和电介质的界面上时，发生全反射，入射光的一部分能量与表面等离子体波发生耦合，引起表面等离子体共振，产生光强急剧减少的反射光。利用光学SPR技术测定时，一般是将一种功能反应物(如配体)固定在传感芯片表面金属膜上，当加入待测样品(受体)并使其与传感芯片上的功能反应物相互作用时，引起体系的折射率变化，从而引起SPR光学信号的改变。由于SPR技术的高识别性、高灵敏性、快速、原位(无需标记)、便捷、实时等优点，SPR传感技术现已被广泛应用于生命科学研究、药物筛选、食品分析、环境监测、农业生产等领域。目前，国内外未见将可卡因检测与SPR技术结合在一起的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对目前胶体金试纸较低的检测灵敏度，提供一种基于SPR的实时、快速、高灵敏度的可卡因检测技术，所述方法检测灵敏度高，大大降低吸毒人员检测的漏检率，具有重要的应用价值。本专利技术基于SPR技术的可卡因检测的方法，是将SPR芯片经EDC/NHS活化后的羧基基团偶联BSA上的氨基后作为传感芯片，当待测样品通过传感芯片表面时，利用表面等离子体共振检测仪检测待检测唾液与分子识别敏感芯片界面处全反射光的光强变化来直接测定唾液中的可卡因含量,具体包括如下步骤：步骤(1)：将SPR芯片放置到SPR仪器中作为传感芯片，仪器温度设定为20～30℃；所述的SPR芯片是先在玻璃基底上表面镀一层2～3nm厚的铬层，再在铬层上表面镀一层40～50nm厚的金膜；金膜表面生成巯基烷醇后用环氧氯丙烷处理生成环氧基，环氧基共价结合葡聚糖后用溴乙酸处理使葡聚糖羧基化，从而得到羧基化的葡聚糖表面；该SPR芯片经EDC/NHS活化后的羧基基团可以偶联BSA上的氨基；步骤(2)：以10～30μL/min的流速往SPR芯片表面通入200～300μLEDC/NHS混合液，活化该芯片表面的羧基基团；所述的EDC/NHS混合液为EDC与NHS的等体积混合溶液；其中EDC为N-(3-二甲基氨丙基)-N’-乙基碳二亚胺，浓度为0.2～0.4M；NHS为N-羟基琥珀酰亚胺，浓度为0.1～0.2M；步骤(3)：在步骤(2)活化表面羧基后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入0.5～2mg/mLBSA-Cocaine溶液，使其偶联到活化过的羧基上，要求目标响应值(RU)达到2000～3000；所述的BSA-Cocaine为人工合成的可卡因完全抗原，即在BSA(牛血清白蛋白)表面偶联了Cocaine(可卡因)分子，可购买获得；pH值为4.5～5.5；步骤(4)：在步骤(3)BSA-Cocaine偶联后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入75～100μL乙醇胺盐酸盐溶液，用以封闭未反应的活化过的羧基位点；所述的乙醇胺盐酸盐溶液的浓度为1～2M；步骤(5)：在步骤(4)处理后SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入30～50μL梯度浓度的可卡因抗体，确定合适的抗体浓度；所述的可卡因抗体为对BSA-Cocaine具有特异性识别的鼠源单克隆抗体。步骤(6)：将一系列不同浓度的30～50μL的可卡因标准品分别与步骤(5)确定的浓度抗体混合后，以10～30μL/min的流速依次通入SPR芯片，建立标准曲线；其中可卡因抗原与步骤(5)确定的浓度抗体等体积；步骤(7)：将30～50μL的待检测样品与步骤(5)确定的浓度抗体等体积混合后，以10～30μL/min的流速通入SPR芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得唾液中可卡因含量。其中，SPR为表面等离子共振的简称。进一步地，步骤(5)中每个可卡因抗体反应完成后以10～30μL/min的流速通入NaOH溶液，使抗原抗体解离，完成芯片再生后再加入下一个浓度的抗体；所述的氢氧化钠溶液为50～100mM。进一步地，在进入步骤(6)前，可进行多次注射步骤(5)确定的最合适浓度抗体,验证实验的重复性。进一步地，步骤(7)中的待测样品可以是唾液，血液，尿液。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术所述方法操作简便，实时、快速，只需将抗原抗体混合通入芯片，便可实时观测结果。(2)本专利技术所述的芯片制备方案成熟，已经商业化，购买方便，并可重复使用上百次，是一种非常经济的检测方法。(3)本专利技术方法所达到的灵敏度较高，时间较短，是其他任何技术都没法比拟的。(4)由于胶体金试纸的灵敏度只有300-1000ng/mL,当待检样品含量低于其灵敏度时，胶体金试纸将无法检测，而本专利技术正好解决了这问题。附图说明图1为不同浓度抗体与SPR响应信号间的关系：抗体浓度依次为6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml。图2为SPR芯片的再生示意图，注射氢氧化钠后SPR信号骤降，并逐渐恢复至初始基线状态。图3为分别注射5次恒定浓度抗体的SPR响应图。图4中a为可卡因检测的标准曲线，b为标准曲线的线性区域。具体实施方式下面结合实施例和附图来详述本专利技术，但不限于此。以下实施例中提到的主要试剂信息见表1；主要仪器与设备信息见表2。表1表2以下实施例所采用的SPR芯片为GE公司生产的CM5芯片，该芯片的表面为羧甲基化葡聚糖，易偶联BSA上的氨基；所使用的SPR仪器为GE公司生产的Biacore3000；胶体金试纸购自艾博生物医药(杭州)有限公司。实施例1：(1)打开SPR仪器，解锁SPR芯片插槽，将SPR芯片放置到插槽中，锁上芯片插槽；SPR仪器温度设定为25℃；(2)以20μL/min的流速往在SPR芯片表面通入注射250μL的EDC和NHS等体积比混合液，活化该芯片表面的羧基基团；其中EDC浓度为0.4M,NHS浓度为0.1M；(3)在活化表面羧基后的SPR芯片上以20μL/min的流速通入1mg/mL的pH5.0的BSA-Cocaine溶液，使其偶联到活化过的羧基上，要求目标响应值(RU)达到300本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于SPR技术的可卡因检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤(1)：将SPR芯片放置到SPR仪器中作为传感芯片，步骤(2)：以10～30μL/min的流速往SPR芯片表面通入200～300μL EDC/NHS混合液，活化该芯片表面的羧基基团；步骤(3)：在步骤(2)活化表面羧基后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入0.5～2mg/mL BSA‑Cocaine溶液，使其偶联到活化过的羧基上，要求目标响应值(RU)达到2000～3000；步骤(4)：在步骤(3)BSA‑Cocaine偶联后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入75～100μL乙醇胺盐酸盐溶液，用以封闭未反应的活化过的羧基位点；步骤(5)：在步骤(4)处理后SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入30～50μL梯度浓度的可卡因抗体，确定合适的抗体浓度；步骤(6)：将一系列不同浓度的30～50μL的可卡因标准品分别与步骤(5)确定的浓度抗体混合后，以10～30μL/min的流速依次通入SPR芯片，建立标准曲线；其中可卡因抗原与步骤(5)确定的浓度抗体等体积；步骤(7)：将30～50μL的待检测样品与步骤(5)确定的浓度抗体等体积混合后，以10～30μL/min的流速通入SPR芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得唾液中可卡因含量。...

【技术特征摘要】
1.一种基于SPR技术的可卡因检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤(1)：将SPR芯片放置到SPR仪器中作为传感芯片，步骤(2)：以10～30μL/min的流速往SPR芯片表面通入200～300μLEDC/NHS混合液，活化该芯片表面的羧基基团；步骤(3)：在步骤(2)活化表面羧基后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入0.5～2mg/mLBSA-Cocaine溶液，使其偶联到活化过的羧基上，要求目标响应值(RU)达到2000～3000；步骤(4)：在步骤(3)BSA-Cocaine偶联后的SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入75～100μL乙醇胺盐酸盐溶液，用以封闭未反应的活化过的羧基位点；步骤(5)：在步骤(4)处理后SPR芯片上以10～30μL/min的流速通入30～50μL梯度浓度的可卡因抗体，确定合适的抗体浓度；步骤(6)：将一系列不同浓度的30～50μL的可卡因标准品分别与步骤(5)确定的浓度抗体混合后，以10～30μL/min的流速依次通入SPR芯片，建立标准曲线；其中可卡因抗原与步骤(5)确定的浓度抗体等体积；步骤(7)：将30～50μL的待检测样品与步骤(5)确定的浓度抗体等体积混合后，以10～30μL/min的流速通入SPR芯片，记录响应信号，代入标准曲线，求得唾液中可卡因含量。2.如权利要求1所述的一种基于SPR技术的可卡因检测方法，其特征在于步骤(1)所述的SPR芯片是先在玻璃基底上镀一层2～3nm厚的铬层，再镀一层40～50nm厚的金膜；金膜表面生成巯基烷醇后用环氧氯丙烷处理生成环氧基，环氧基共价结合葡聚糖后用溴乙酸处理...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继业，孟凡伟，
申请(专利权)人：浙江警察学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33