与溶酶体酶融合的载有甘露糖‑6‑磷酸的肽制造技术

一种靶向治疗剂，其包括溶酶体酶和溶酶体靶向部分，所述溶酶体靶向部分是含有至少一个N‑连接的糖基化位点的肽。产生所述靶向治疗剂的方法可包括编码所述靶向治疗剂的核苷酸和共同表达GNPT的宿主细胞。包含所述靶向治疗剂的药物组合物和使用其治疗溶酶体贮积病的方法。

With the fusion of lysosomal enzymes containing mannose 6 phosphoric acid peptide

A targeted therapeutic agents, including lysosomal enzymes and lysosomal targeting, the lysosomal targeting part containing at least one N linked glycosylation sites peptide. A method of producing the targeted therapeutic agent may include nucleotide encoding the targeted therapeutic agent and a host cell for CO expressing GNPT. Pharmaceutical compositions comprising the targeted therapeutic agents and methods of using the same for the treatment of lysosomal storage disorders.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉引用本申请要求2014年8月11日提交的美国临时专利申请No.62/036,082的优先权，该临时专利申请的公开内容在此整体并入。专利技术背景超过四十种溶酶体贮积病直接或间接由一种或多种溶酶体酶的缺少或缺乏引起。山菲立普综合症(Sanfilipposyndrome)或粘多糖贮积症III(MPSIII)是一种此类疾病。它是一种罕见的遗传病，特征为缺乏参与糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)降解的酶。已经鉴别MPSIII的四种不同形式，称为MPSIIIA、B、C和D。每一者的特征为缺少或缺乏不同溶酶体酶。IIIB型粘多糖贮积症(MPSIIIB；B型山菲立普病)是一种由酶a-N-乙酰基-氨基葡糖苷酶(Naglu)缺乏引起的常染色体隐性遗传病，导致硫酸乙酰肝素积累在特别是脑中神经元和胶质细胞的溶酶体中，以及硫酸乙酰肝素在别处的其它溶酶体积累。MPSIIIB本身主要显现在脑中。酶替代疗法(ERT)已用于递送酶以治疗各种溶酶体贮积病。通常，溶酶体酶在细胞溶质中合成，然后横越内质网(ER)，在内质网中其经N-连接的高甘露糖型碳水化合物糖基化。在高尔基体中，糖蛋白上的高甘露糖碳水化合物接着经一系列糖基转移酶修饰，变成成熟N-聚糖；修饰之一是添加甘露糖-6-磷酸(M6P)。携带此修饰的蛋白质接着经由M6P部分与非阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)的结合而靶向溶酶体。酶替代疗法的功效关键取决于代替酶的适当溶酶体靶向。然而，重组产生的Naglu蛋白的特征为M6P磷酸化显著缺少，使得此酶的溶酶体靶向和其有效用于ERT的用途很难。因此，仍然需要研发一种溶酶体靶向的替代方法以保证有效的酶替代疗法。专利技术概要本专利技术提供一种靶向治疗剂，其包括溶酶体酶和溶酶体靶向部分，其中所述溶酶体靶向部分是含有至少一个N-连接的糖基化位点的肽。在一些实施方案中，肽含有N-连接的糖基化。在一些实施方案中，肽含有含M6P基团的N-连接的糖基化。在一些实施方案中，溶酶体酶选自表2。在一些实施方案中，溶酶体酶是N-乙酰葡糖胺糖苷酶(Naglu)蛋白质。在一些实施方案中，Naglu蛋白质包括与SEQIDNO.：1至少80％、90％或95％一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，Naglu蛋白质包括与SEQIDNO.：1一致的氨基酸序列。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分是选自以下的肽：鞘脂激活蛋白原、白血病抑制因子、E1A刺激基因的细胞阻遏子以及其片段。在一些实施方案中，肽包括与SEQIDNO.4、6或9至少80％、90％或95％一致的序列。在一些实施方案中，肽包括与SEQIDNO.4、6或9一致的序列。在一些实施方案中，靶向治疗剂是融合蛋白。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分融合至溶酶体酶的N端。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分融合至溶酶体酶的C端。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分与溶酶体酶经由连接子融合。在一些实施方案中，连接子包含序列GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(SEQIDNO.：15)。在一些实施方案中，融合蛋白与SEQIDNO.18、19或20的氨基酸序列至少80％或95％一致。在一些实施方案中，融合蛋白与SEQIDNO.18、19或20的氨基酸序列一致。在一些实施方案中，靶向治疗剂是融合蛋白。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分融合至溶酶体酶的N端。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分融合至溶酶体酶的C端。在一些实施方案中，溶酶体靶向部分与溶酶体酶经由连接子融合。在一些实施方案中，连接子包含序列GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(SEQIDNO.：15)。在一些实施方案中，融合蛋白与SEQIDNO.23、24或25的氨基酸序列至少80％或95％一致。在一些实施方案中，融合蛋白与SEQIDNO.23、24或25的氨基酸序列一致。在一方面，本专利技术提供一种编码本文中公开的任一融合蛋白的核酸。在一方面，本专利技术提供一种包括本文中公开的任一核酸的载体，和一种包括所述载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或人细胞。在一些实施方案中，细胞是CHO细胞系。在一些实施方案中，宿主细胞共同表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)。在一些实施方案中，宿主细胞包括编码GNPT的外源性核酸。在一些实施方案中，宿主细胞具有活化的内源性GNPT表达。在一方面，本专利技术提供一种用于产生靶向治疗融合蛋白的方法，其包括培养包含编码本文中描述的融合蛋白的核酸的细胞，其中所述细胞共同表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)，且回收由所述细胞产生的融合蛋白。在一方面，本专利技术提供一种药物组合物，其包括本文中描述的任一靶向治疗剂和药学上可接受的载剂。在一方面，本专利技术提供一种治疗溶酶体贮积病的方法，其通过向需要治疗的受试者施用本文中描述的任一药物组合物。在一些实施方案中，溶酶体贮积病是B型山菲立普综合症。在一些实施方案中，药物组合物经静脉内、皮下、鞘内和/或其组合施用。图示简单说明图1展示Naglu-IGFII、Naglu-CREG和Naglu-SapDC融合蛋白的M6P受体体外结合分析。图2展示Naglu-IGFII和Naglu-LIF融合蛋白的M6P受体体外结合分析。图3展示监测M6P受体介导的Naglu-CREG、Naglu-SapDC和Naglu-LIF融合蛋白的细胞摄取的体外分析以及与由相同分析测定的Naglu-IGFII的细胞摄取比较的结果。图4展示使用抗M6P抗体的蛋白质印迹分析，展示野生型HT1080细胞或过度表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)的细胞系中产生的酸性α-萄糖苷酶(GAA)、Naglu-LIF融合蛋白(Naglu-LIF)、芳基硫酸酯酶A(ARSA)、艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)、乙酰肝素-N-硫酸胺酶(HNS)和葡糖脑苷脂酶(GCB)蛋白质的M6P相对含量。蛋白质印迹分析在使用糖苷内切酶H去除M6P前(-)和后(+)进行。图5证实当在野生型HT1080细胞或过度表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)的细胞系中产生时艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)与M6P受体结合的体外结合。图6说明在野生型HT1080细胞或过度表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)的细胞系中产生的艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(I2S)的体外细胞摄取。图7展示HT1080细胞或过度表达GNPT的细胞系(GlcNAc-P-T)中产生的重组Naglu蛋白质的体外M6P受体结合。图8展示HT1080细胞或过度表达GNPT的细胞系(GlcNAc-P-T)中产生的各种Naglu融合蛋白的体外M6P受体结合。图9展示通过PAD-HPLC，对来源于Naglu-SapDC和Naglu-LIF的M6P单糖进行定量。I2S的M6P含量用作对照。图10说明在野生型HT1080细胞或过度表达N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶(GNPT)的细胞系中产生的Naglu-SapDC的体外细胞摄取。Naglu-IGFII的细胞摄取用作对照。图11说明在野生型HT1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种靶向治疗剂，其包含：溶酶体酶；和溶酶体靶向部分，其中所述溶酶体靶向部分是含有至少一个N‑连接的糖基化位点的肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.08.11 US 62/036,0821.一种靶向治疗剂，其包含：溶酶体酶；和溶酶体靶向部分，其中所述溶酶体靶向部分是含有至少一个N-连接的糖基化位点的肽。2.如权利要求1所述的靶向治疗剂，其中所述肽含有N-连接的糖基化。3.如权利要求1所述的靶向治疗剂，其中所述肽含有含M6P基团的N-连接的糖基化。4.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述溶酶体酶选自表2。5.如权利要求1至3中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述溶酶体酶是N-乙酰葡糖胺糖苷酶(Naglu)蛋白质。6.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述Naglu蛋白质包含与SEQIDNO.：1至少80％一致的氨基酸序列。7.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述Naglu蛋白质包含与SEQIDNO.：1至少90％一致的氨基酸序列。8.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述Naglu蛋白质包含与SEQIDNO.：1至少95％一致的氨基酸序列。9.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述Naglu蛋白质包含与SEQIDNO.：1一致的氨基酸序列。10.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述溶酶体靶向部分是选自以下的肽：鞘脂激活蛋白原、E1A刺激基因的细胞阻遏子、白血病抑制因子以及其片段。11.如权利要求10所述的靶向治疗剂，其中所述肽包含与SEQIDNO.4、6或9至少80％一致的序列。12.如权利要求10所述的靶向治疗剂，其中所述肽包含与SEQIDNO.4、6或9至少90％一致的序列。13.如权利要求10所述的靶向治疗剂，其中所述肽包含与SEQIDNO.4、6或9至少95％一致的序列。14.如权利要求10所述的靶向治疗剂，其中所述肽包含与SEQIDNO.4、6或9一致的序列。15.如前述权利要求中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述靶向治疗剂是融合蛋白。16.如权利要求15所述的靶向治疗剂，其中所述溶酶体靶向部分融合至所述溶酶体酶的N端。17.如权利要求15所述的靶向治疗剂，其中所述溶酶体靶向部分融合至所述溶酶体酶的C端。18.如权利要求15至17中任一项所述的靶向治疗剂，其中所述溶酶体靶向部分与所述溶酶体酶经由连接子融合。19.如权利要求17所述的靶向治疗剂，其中所述连接子包含序列GAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAPGGGGGAAAAAGGGGGGAP(SEQIDNO.：15)。20.如权利要求15至19中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·F·康西诺，B·斯特拉克罗格，M·梅亚潘，A·W·诺顿，B·张，A·伊斯肯德瑞安，L·Y·劳，D·伦德伯格，A·罗曼什柯，H·纳伊米，
申请(专利权)人：夏尔人类遗传性治疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US